第三章 發(fā)酵工程原理及其在食品工業(yè)中的應用

第三章發(fā)酵工程原理及其在食品工業(yè)中的應用第一節(jié)概述

發(fā)酵：借助微生物在有氧或無氧條件下的生命活動來制備微生物菌體本身，或其初級代謝產(chǎn)物、次級代謝產(chǎn)物的過程。

發(fā)酵工程：也稱微生物工程。利用微生物生長速度快、生長條件簡單以及代謝過程特殊等特點，在合適條件下，通過現(xiàn)代化工程技術手段，最大限度地發(fā)揮微生物的某種特定功能，以生產(chǎn)出人類所需的產(chǎn)品。

一、發(fā)酵工程的定義

（一）發(fā)酵工程主要研究對象1.大規(guī)模微生物細胞培養(yǎng)過程；2.大規(guī)模培養(yǎng)基滅菌和空氣滅菌過程；3.微生物細胞生長和產(chǎn)物形成動力學；4.發(fā)酵過程的優(yōu)化；5.生物反應器的放大和設計；6.發(fā)酵過程的參數(shù)監(jiān)控和計算機應用；7.發(fā)酵產(chǎn)品的分離和純化等工程技術問題。（二）發(fā)酵工程產(chǎn)品類型

1.以菌體為產(chǎn)品。(酵母菌、單細胞蛋白)2.以微生物的酶為產(chǎn)品。（堿性蛋白酶、淀粉酶）3.以微生物的代謝產(chǎn)物為產(chǎn)品。（氨基酸、脂類）4.利用發(fā)酵作用，對某種化合物的化學結構進行改造，即產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化過程。（醋的釀造）二、發(fā)酵工程的發(fā)展簡史

（一）天然發(fā)酵階段

主要產(chǎn)品有黃酒、白酒、啤酒、酒精和醋等。多數(shù)產(chǎn)品為厭氧發(fā)酵、非純種培養(yǎng)、憑經(jīng)驗傳授技術和產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定是這個階段的特點。（二）純培養(yǎng)技術的建立

純培養(yǎng)技術的建立是發(fā)酵技術發(fā)展的第一個轉(zhuǎn)折時期。（三）通氣攪拌發(fā)酵技術的建立

通氣攪拌發(fā)酵技術的建立是發(fā)酵工業(yè)上的第二個轉(zhuǎn)折點。

（四）代謝控制發(fā)酵技術由氨基酸發(fā)酵而開始的代謝控制發(fā)酵，使發(fā)酵工業(yè)進入一個新的階段。隨后，核苷酸、酶制劑以及有機酸等方面也利用代謝調(diào)控技術進入發(fā)酵生產(chǎn)。（五）開拓發(fā)酵原料時期

石油化工副產(chǎn)物石蠟、醋酸、甲醇以及甲烷等碳氫化合物被用來作為發(fā)酵原料。（六）基因工程階段使發(fā)酵工業(yè)能夠生產(chǎn)出自然界微生物所不能合成的產(chǎn)物，如胰島素、干擾素、白介素和多細胞生長因子等，大大地拓寬了發(fā)酵工業(yè)的范圍，使發(fā)酵工業(yè)發(fā)生了革命性變化。

三、發(fā)酵工藝及方法

（一）固體發(fā)酵法利用固體基質(zhì)，如麩皮、米糠、秸稈等為主要原料，再根據(jù)需要添加其他谷糠、豆餅、無機鹽等，加水拌成含水量適度的半固態(tài)物料作為培養(yǎng)基，供微生物的生長繁殖和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。目前利用固體發(fā)酵法生產(chǎn)的產(chǎn)品有酒曲、白酒、醬油、食醋、腐乳、酶制劑、食用菌等。（二）液體發(fā)酵法

利用液態(tài)培養(yǎng)基，進行微生物的生長繁殖和形成人們所需要的代謝產(chǎn)物。根據(jù)通氣（供氧）或不通氣及通氣方法的不同，又分為液體表面發(fā)酵法、液體深層通氣發(fā)酵法、液體厭氧發(fā)酵法三種。

固體發(fā)酵與液體（深層）發(fā)酵相比，具有以下優(yōu)點1.固體發(fā)酵單位體積的酶產(chǎn)量往往高于液體發(fā)酵幾倍，甚至幾十倍，特別適合真菌酶類和一些次級代謝產(chǎn)物及大型真菌的生產(chǎn)。2.操作簡單，適應性強，原料來源廣，價格低廉，可以利用多種其他發(fā)酵工藝無法利用的糧食加工下腳料或廢料進行生產(chǎn)。3.固體發(fā)酵僅需空氣自然對流或小量通風即可，能耗低。4.固體發(fā)酵的產(chǎn)物提取一般步驟少，降低生產(chǎn)成本。有些產(chǎn)物，如飼料或飼料添加劑，不需要分離步驟，全部發(fā)酵物質(zhì)可以作為產(chǎn)品。5.發(fā)酵工藝全過程無廢水或很少，可以減少環(huán)境污染。

1.液體表面發(fā)酵法又稱液體淺盤發(fā)酵法或靜置培養(yǎng)法，是將已滅菌的液體培養(yǎng)基，接入微生物菌種后，裝入可密閉的發(fā)酵箱內(nèi)盤架上的淺盤中，薄薄一層，液層厚約1～2cm，然后向盤架間通入無菌空氣，通過淺盤內(nèi)培養(yǎng)基的表面供給氧氣，并維持一定的溫度進行發(fā)酵。

優(yōu)點：無須攪拌，動力消耗省。

缺點：控制雜菌污染較難，所需場地較大，勞動強度大，生產(chǎn)效率低。

2.液體深層通氣發(fā)酵法將微生物接入裝有無菌液體培養(yǎng)基的封閉發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)或發(fā)酵的技術。

優(yōu)點：①容易按照生產(chǎn)菌種對代謝營養(yǎng)物以及不同生理時期的通風、攪拌、溫度和培養(yǎng)基pH值等的要求，選擇最佳培養(yǎng)條件。②產(chǎn)品純度高，質(zhì)量也較穩(wěn)定，還具有機械化程度高、勞動強度小、設備利用率高等優(yōu)點。

缺點：易染菌、無菌操作要求高、設備投資大。

3.液體厭氧發(fā)酵法能作大規(guī)模液體培養(yǎng)的厭氧菌僅丙酮丁醇梭菌，用于丙酮的發(fā)酵生產(chǎn)。酒精、啤酒、葡萄酒、酸乳的發(fā)酵屬于兼性厭氧發(fā)酵，菌種培養(yǎng)時需要適量通氣，發(fā)酵時則不通氣。

優(yōu)點：可省略通氣和攪拌設備，簡化工藝過程，還能大大節(jié)約能源的消耗，提高生產(chǎn)效率。四、我國發(fā)酵工業(yè)與先進國家相比，存在的

主要差距1.傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品及產(chǎn)量發(fā)展過大過快酒類、谷氨酸、檸檬酸、普通酶制劑和抗生素等。2.發(fā)酵產(chǎn)品工業(yè)產(chǎn)值在國民生產(chǎn)總值中的比例較低（1%）以下3.發(fā)酵產(chǎn)品檔次低，品種少，不配套。4.技術創(chuàng)新力度不夠，低水平重復現(xiàn)象嚴重。1.菌種能在廉價原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長和繁殖，并且生成所需的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量要高。2.菌種可以在要求不高，易于控制的培養(yǎng)條件下（糖濃度、溫度、pH值、溶解氧和滲透壓等）迅速生長和發(fā)酵。3.菌株生長速度和產(chǎn)物生成速度應較快，發(fā)酵周期較短。第二節(jié)食品發(fā)酵菌種篩選一、食品發(fā)酵工業(yè)對微生物菌種的一般要求

4.根據(jù)代謝控制的要求，選擇單產(chǎn)高的營養(yǎng)缺陷型突變菌株、調(diào)節(jié)突變菌株或野生菌株。5.選擇一些不易被噬菌體感染的菌株。6.生產(chǎn)菌種純度高，不易變異退化，以保證發(fā)酵生產(chǎn)和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。7.菌體不能是病源菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)（包括激素和毒素等），以保證安全。二、食品發(fā)酵工業(yè)常用微生物（一）細菌

發(fā)酵工業(yè)中常用的細菌：枯草芽孢桿菌（蛋白酶、淀粉酶）、乳酸桿菌（乳酸）、醋酸桿菌（醋酸）、梭狀芽孢桿菌（丙酮、丁醇）、巨大芽孢桿菌（葡萄糖異構酶）、大腸桿菌（谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶等）、產(chǎn)氨短桿菌（氨基酸、核苷酸）等。（二）酵母菌發(fā)酵工業(yè)中常用的酵母：釀酒酵母、漢遜酵母和各種假絲酵母等。除了用來釀造飲料酒、酒精和烤制面包外，還可用于生產(chǎn)甘油、酶制劑、有機酸等。此外，由于酵母菌體本事富含蛋白質(zhì)、核糖核酸、細胞色素C、酶類及多種維生素，又是醫(yī)藥、食品、飼料行業(yè)中的重要原料。（三）霉菌發(fā)酵工業(yè)中常用的霉菌：根霉屬，主要產(chǎn)淀粉酶、脂肪酶、乳酸、甾體激素等；毛霉屬，主要產(chǎn)蛋白酶、凝乳酶、草酸、甾體激素等；木霉屬，主要產(chǎn)纖維素酶等；青霉屬，主要產(chǎn)脂肪酶、葡萄糖氧化酶、維生素等；曲霉屬，主要產(chǎn)維生素C、檸檬酸、各種水解酶類等。（四）擔子菌擔子菌的多糖物質(zhì)具有很強的生理活性，尤其是提高機體免疫力、抗腫瘤作用等方面越來越引起人們重視。此外，擔子菌通過液體發(fā)酵得到的菌絲體富含蛋白質(zhì)、多糖、維生素等，可用于食品、醫(yī)藥和保健行業(yè)。（五）藻類自然界分布極廣的一大群自養(yǎng)微生物資源，許多國家已把它用作人類保健食品和飼料。三、生產(chǎn)菌種選育

（一）自然選育

在生產(chǎn)過程中，不經(jīng)過人工誘變處理，利用菌種的自發(fā)突變而進行菌種篩選的過程。（二）誘變育種

利用物理或化學因素處理微生物細胞群體，促使其中少數(shù)細胞遺傳物質(zhì)的分子結構發(fā)生改變，從而引起菌體發(fā)生遺傳性變異，再用合理的篩選方法從細胞群體中篩選出少數(shù)具有優(yōu)良性狀的菌株。（三）雜交育種（原生質(zhì)體融合）

指兩個基因型不同的菌株通過結合或原生質(zhì)體融合使遺傳物質(zhì)重新組合，再從中分離和篩選出具有新性狀的菌株。（四）分子育種應用基因工程方法進行的育種。四、生產(chǎn)中常用菌種的保藏

（一）生產(chǎn)中菌種來源自然界分離篩選；菌種保藏機構獲得；已有菌株中篩選突變株。（二）菌種保藏原理

根據(jù)微生物生理、生化特點人工創(chuàng)造條件，使微生物的代謝處于不活潑，生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。這些人工造成的環(huán)境主要是低溫、干燥和缺氧三者，在此種條件下，使菌株很少發(fā)生突變，以達到保持純種的目的。

（三）菌種保藏方法

1.冷凍保藏

普通冷凍保藏技術（－5～－20℃）、超低溫冷凍保藏技術（－60～－80℃）和液氮（－196℃）冷凍保藏技術

2.凍干保藏

3.傳代保藏將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代，然后在一定溫度下生長和保存的傳代保藏方法。

4.礦物油中浸沒保藏

將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下保藏。5.干燥－載體保藏干孢子形成真菌和鏈霉菌時可通過吸附于干燥惰性固相載體如白土、硅膠或陶瓷表面獲得較長時間的保藏。（四）菌種保藏注意事項1.菌種在保藏前所處的狀態(tài)一般以稍低于生長最適溫度培養(yǎng)至孢子成熟的菌種進行保存，效果較好。2.菌種保藏所用的基質(zhì)斜面低溫保藏所用的培養(yǎng)基，碳源比例應少些。3.操作過程對細胞結構的損害（五）國內(nèi)重要保藏菌種機構

1.普通微生物菌種保藏管理中心（CCGMC）中國科學院微生物研究所，北京（AS）：真菌、細菌中國科學院武漢病毒研究所，武漢（AS-IV）：病毒2.農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（ACCC）中國科學院土壤肥料研究所，北京（ISF）3.工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）中國食品發(fā)酵工業(yè)研究所，北京（IFFI）

4.獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC）農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京（CIVBP）

5.醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心（CMCC）中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所，南京（ID）：真菌衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，北京（NICPBP）：細菌中國醫(yī)學科學院病毒研究所，北京（IV）：病毒6.抗生素菌種保藏管理中心（CACC）中國醫(yī)學科學院抗菌素研究所，北京（IA）四川抗菌素工業(yè)研究所，成都（SIA）：新抗菌素菌種華北制藥廠抗菌素研究所，石家莊（IANP）：生產(chǎn)用抗菌素菌種

第三節(jié)培養(yǎng)基的組成及制備

培養(yǎng)基：人工配制的供微生物或動、植物細胞生長、繁殖、代謝和合成人們所需要的產(chǎn)物的營養(yǎng)物質(zhì)和原料。（一）按培養(yǎng)基的成分分類

合成培養(yǎng)基：原料的化學成分明確、穩(wěn)定，適用于研究菌種基本代謝的物質(zhì)變化。但是生產(chǎn)某些疫苗等生物制品的過程中，為了防止雜蛋白等其他雜質(zhì)混入，也常用合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分單一且價格昂貴，故不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

一、培養(yǎng)基的類型

天然培養(yǎng)基：原料是一些天然的動植物產(chǎn)品，相對于合成培養(yǎng)基來說，其成分比較復雜，如玉米粉、花生粉、豆餅粉等。

優(yōu)點：營養(yǎng)豐富，適合于微生物的生長繁殖和目的產(chǎn)物的合成。一般天然培養(yǎng)基中不需要另加微量元素、維生素等物質(zhì)，且培養(yǎng)基組成的原料來源豐富、價格低廉，適合于工業(yè)生產(chǎn)。

缺點：由于天然培養(yǎng)基的組分復雜，不同產(chǎn)地、不同季節(jié)、不同品種的相同原料，各種成分含量有所不同，不易重復，若對原料質(zhì)量等方面不加控制會嚴重影響生產(chǎn)的穩(wěn)定性。

（二）按培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)分類固體培養(yǎng)基：主要成分為麩皮、大米、小米、稻糠和瓊脂等，有的還含有一些其他營養(yǎng)成分。比較適用于菌種的分離和保存，也廣泛應用于曲霉菌和有子實體的真菌類，如香菇、木耳、靈芝等的生產(chǎn)。半固體培養(yǎng)基：在配好的液體培養(yǎng)基中加入瓊脂，一般用量為0.5%～0.8%，培養(yǎng)基呈半固體狀態(tài)。主要用于鑒定菌種、觀察細菌運動特征及噬菌體的效價測定等。液體培養(yǎng)基：80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分。流動好，輸送方便，有利于氧氣、其他物質(zhì)和熱量的傳遞，便于發(fā)酵參數(shù)的控制，是搖瓶發(fā)酵和大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵最常用的培養(yǎng)基。

（三）按用途分類

斜面培養(yǎng)基：供菌種繁殖的一種常用的固體培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的要求是能使菌體迅速生長，并不易引起菌種發(fā)生變異。

種子培養(yǎng)基：供微生物大量生長，為發(fā)酵提供活力強的種子。配制原則：使種子生長旺盛，各種有關的初級代謝酶的活力高，有利于接入發(fā)酵培養(yǎng)基后大量、快速合成產(chǎn)物。種子培養(yǎng)基一般要求有機氮源和維生素的比例較高。

發(fā)酵培養(yǎng)基：供菌種生長、繁殖，得到所需要的目標產(chǎn)物。既要使種子接種后能迅速生長達到一定的菌體濃度，又要使長好的菌體能迅速合成所需的產(chǎn)物。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成除有菌體生長所必需的碳源、氮源、磷源等外，還要有產(chǎn)物合成所需的某些特定元素、前體和促進劑等。

孢子培養(yǎng)基：主要用于制備微生物孢子。要求此種培養(yǎng)基能形成大量的優(yōu)質(zhì)孢子，但不能引起菌種變異。

繁殖和保藏培養(yǎng)基：主要用于菌種保藏，一般根據(jù)微生物的種類和營養(yǎng)要求加以選擇。選擇培養(yǎng)基：根據(jù)某（種）類微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)δ撤N化學、物理因素的抗性而設計的培養(yǎng)基，其功能是使混合菌樣品中劣勢菌變成優(yōu)勢菌，從而提高該（種）類的篩選效率。二、培養(yǎng)基的配制原則（一）根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基

不同的微生物所需營養(yǎng)物質(zhì)不同，其培養(yǎng)基配方也不同。必須了解不同生產(chǎn)菌種的培養(yǎng)條件、代謝途徑、代謝產(chǎn)物的化學性質(zhì)，從而確定最優(yōu)的培養(yǎng)基。（二）合適的碳氮比氮源過多，會使菌體生長過于旺盛，pH值偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累；氮源不足，則菌體繁殖量少，從而影響產(chǎn)量。碳源過多，則容易形成較低的pH值，不利于菌體的生長；若碳源不足則易引起菌體衰老和自溶。另外，碳氮比不當還會影響菌體按比例地吸收營養(yǎng)物質(zhì)，直接影響菌體的生長和產(chǎn)物的形成。

微生物在不同的生長階段，對碳氮比的最適要求也不一樣。一般工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比約為100∶0.2～2.0?？焖倮玫矗ㄈ缌蛩徜@）：容易被菌體利用來生長，對某些產(chǎn)物的合成，特別是抗生素的合成有調(diào)節(jié)作用。

慢速利用氮源（如黃豆粉、花生粉）：對延長次級代謝產(chǎn)物的分泌期和提高產(chǎn)物產(chǎn)量有一定好處。

（三）合適的pH值

在配制培養(yǎng)基時，要注意生理酸堿性物質(zhì)，以及pH值緩沖劑的加入和搭配。要根據(jù)菌種的性能、其生長和合成產(chǎn)物時pH值的變化情況以及最適pH值控制范圍等，綜合考慮選用何種生理酸堿物質(zhì)及其用量，從而保證在整個發(fā)酵過程中pH值都能維持在最佳狀態(tài)；也可考慮用中間補料來控制pH值。（四）合適的滲透壓營養(yǎng)物質(zhì)濃度過低，不利于菌體的生長，也不利于提高產(chǎn)物的產(chǎn)量和設備利用率。但是，營養(yǎng)物質(zhì)濃度過高，則由于培養(yǎng)基溶液的滲透壓太大，會抑制微生物的生長，也不利于溶氧。同時培養(yǎng)基中的離子濃度也會影響微生物的生長及代謝。三、發(fā)酵工業(yè)中常用的原料

（一）工業(yè)上常用碳源

目前使用最廣的碳源是淀粉，主要來自玉米、谷物、木薯等，還可以用經(jīng)水解得到的各種淀粉糖，如葡萄糖、麥芽糖等。使用最多的是葡萄糖，另外還有蔗糖、乳糖等。用于疫苗、一些基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)的培養(yǎng)基，通常采用牛血清蛋白、牛肉汁、酵母粉等作為碳源。（二）工業(yè)上常用氮源氨水、硫酸銨、硝酸銨等為無機氮源；黃豆粉、花生粉、酵母粉、魚粉等都是有機氮源。一般來說，有機氮源更有利于微生物的生長。

表2-1工業(yè)上常用的碳源及其來源碳源來源葡萄糖純葡萄糖、水解淀粉乳糖純?nèi)樘?、乳清粉淀粉玉米、大米、甘薯、大麥等蔗糖甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗紅糖、精白糖等表2-2幾種常用有機氮源的含氮量氮源含氮量/%豆粕8.l花生粉8.0酵母水解物8.0血粉12.3大豆粉8.0菜子餅6.0棉子餅6.3玉米漿4.5（三）無機鹽根據(jù)需求量通常將無機鹽分為主要元素和微量元素。微量元素需求量極少，混雜在水或其他營養(yǎng)物中的極微數(shù)量就足以滿足微生物的需要。但無特殊原因，一般配制培養(yǎng)基時沒有另外加入微量元素的必要。

（四）水天然水含有不同類型和不同量的礦物質(zhì)，具有一定的硬度和堿度，水的質(zhì)量對微生物的生長和發(fā)酵產(chǎn)物的形成有一定影響。如一些著名的釀酒廠附近都有優(yōu)質(zhì)的水源。

（五）生長因子

一類對微生物正常代謝必不可少且不能用簡單的碳源或氮源自行合成的有機物。廣義的生長因子除了維生素外，還包括堿基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺類、脂肪酸等。（六）消泡劑常用的消泡劑有植物油脂、動物油脂和一些化學合成的高分子化合物。植物油脂：玉米油、豆油、棉籽油、菜籽油動物油脂：鯨魚油、豬油高分子化合物：聚醚類和硅酮類

四、培養(yǎng)基的滅菌

（一）消毒和滅菌

消毒:指殺滅引起感染的微生物。在治療學與衛(wèi)生學中消毒指的是殺滅病原微生物；在工業(yè)微生物中消毒指的是除去會引起污染的微生物。

滅菌:指殺死一切微生物（包括繁殖體和芽孢等），不分病原和非病原微生物。消毒一般多指化學因素處理，滅菌一般多指物理因素處理。消毒的結果并不一定是無菌狀態(tài)，滅菌的結果則是無菌狀態(tài)。

（二）滅菌方法

1.干熱滅菌法大多數(shù)的干熱滅菌是利用電熱或紅外線在某設備內(nèi)加熱到一定溫度將微生物殺死。干熱對微生物有氧化、蛋白質(zhì)變性和電介質(zhì)濃縮引起中毒等作用，氧化作用導致微生物死亡是干熱滅菌的主要根據(jù)。干熱滅菌用于要求滅菌后保持干燥的物料、器具等。2.濕熱滅菌法借助蒸汽釋放的熱能使微生物細胞中的蛋白質(zhì)、酶和核酸分子內(nèi)部的化學鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆的變性，從而使微生物死亡。在有水分存在的情況下，蛋白質(zhì)更易受熱凝固變性。

（1）巴斯德消毒法

將待消毒的液體食品在63～65℃下保持30min，然后迅速冷卻，以殺死其中可能存在的病原菌，保持食品的營養(yǎng)和風味。啤酒、黃酒、醬油、醋、牛奶等均用此法消毒。

（2）高壓蒸汽滅菌法

工業(yè)發(fā)酵菌種培養(yǎng)及生產(chǎn)過程培養(yǎng)基、管道和設備的滅菌主要利用此方法。一般在0.1MPa蒸汽壓（對應溫度為121.0℃）下處理15～30min，即可達到滅菌目的。（3）間歇滅菌法將待滅菌物品置于蒸鍋（蒸籠）內(nèi)常壓蒸15～30min，以殺死其中微生物營養(yǎng)細胞。冷后置于一定溫度（28～37℃）下培養(yǎng)過夜，促使第一次蒸煮中未被殺死的芽孢或孢子萌發(fā)成營養(yǎng)細胞，再用同樣的方法處理。如此反復三次，可殺滅所有營養(yǎng)細胞、芽孢和孢子，達到滅菌的目的。一般只用于有些不宜用高壓蒸汽滅菌的物品和培養(yǎng)基，例如，某些糖、明膠或牛奶培養(yǎng)基等。

3.過濾除菌法對于蛋白質(zhì)、酶、血清、維生素等熱敏性物質(zhì)，常采用微孔過濾除菌法。常用的微孔過濾有陶瓷膜、金屬膜、聚砜膜、尼龍膜，還有熔結玻璃細菌濾器、火棉膠、硝化纖維素濾膜等。一般孔徑為0.2～0.4μm，最大孔徑不超過1μm的過濾介質(zhì)可以得到無菌濾液。缺點是無法去除噬菌體或病毒。4.放射性滅菌法通常用紫外線、x射線和γ射線等進行滅菌，以紫外線最常用。紫外線對芽孢和營養(yǎng)細胞都能起作用，缺點：細菌芽孢和霉菌孢子對紫外線的抵抗力強，而且紫外線的穿透力低，只能用于表面滅菌，對固體物料滅菌不徹底，也不能用于液體物料滅菌。一般用于無菌室、培養(yǎng)室等空間滅菌。

5.化學藥品滅菌法高錳酸鉀溶液：滅菌作用是使蛋白質(zhì)、氨基酸氧化，使微生物死亡,常用濃度為0.1%-0.25%。漂白粉：殺菌作用是次氯酸鈉分解為次氯酸，后者不穩(wěn)定，在水溶液中分解為新生態(tài)氧和氯，使細菌受強烈氧化作用而導致死亡，對殺死細菌和噬菌體均有效。殺菌用的漂白粉：低標準漂白粉（含30%有效氯）、高標準漂白粉（含70%有效氯）和商品次氯酸鈉溶液（含15%有效氯）。75%酒精溶液：殺菌作用在于使細胞脫水，引起蛋白質(zhì)凝固變性,對營養(yǎng)細胞、病毒、霉菌孢子均有殺滅作用，但對細菌芽孢的殺滅能力較差。常用于皮膚和器具表面殺菌。（一）液體培養(yǎng)基分批滅菌（實罐滅菌）、連續(xù)滅菌。（二）固體培養(yǎng)基蒸料，在固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)醬油和食醋中用得最廣。五、生產(chǎn)上培養(yǎng)基的滅菌方法第四節(jié)菌種活化與擴大培養(yǎng)

菌種活化與擴大培養(yǎng):指將保存的處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面培養(yǎng)活化后，再經(jīng)過茄子瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量純種的過程。這些純種培養(yǎng)物又稱為種子。種子擴大培養(yǎng)的一般工藝流程：包括實驗室制備階段和生產(chǎn)車間種子制備階段。

一、實驗室種子制備

（一）菌體制備1.細菌和放線菌類細菌培養(yǎng)多采用肉湯瓊脂培養(yǎng)基，而放線菌類的孢子培養(yǎng)多數(shù)采用人工合成瓊脂培養(yǎng)基。細菌培養(yǎng)溫度大多為37℃，1～3d；放線菌類孢子的培養(yǎng)溫度大多數(shù)為28℃，部分菌種為30℃或37℃，培養(yǎng)時間一般為4～7d，也有的為14d。孢子成熟后，于5℃冰箱（庫）內(nèi)保存?zhèn)溆?，存放時間一般在一周內(nèi)，少數(shù)菌種可存放1～3個月。2.霉菌類霉菌類孢子的培養(yǎng)多數(shù)采用大米、小米、麥麩等天然固體培養(yǎng)基。制好的孢子可放在5℃冰箱中保存?zhèn)溆?，也可通過真空干燥進行保存?zhèn)溆?。?jīng)過真空干燥的孢子菌種可在生產(chǎn)上連續(xù)使用半年左右。（二）搖瓶種子制備

某些菌種的孢子發(fā)芽和菌體繁殖速度較緩慢，為了縮短種子罐培養(yǎng)周期和穩(wěn)定種子質(zhì)量，將孢子經(jīng)搖瓶培養(yǎng)成菌體后再進罐，制成的種子稱為搖瓶種子。

制備搖瓶種子的目的：使孢子發(fā)芽長成健壯的菌體，同時對斜面孢子的質(zhì)量和無菌情況進行考察，然后擇優(yōu)選用。

優(yōu)點：大大縮小了的種子罐。

缺點：工藝過程長，操作過程中染菌幾率較高。

二、生產(chǎn)車間種子制備

（一）種子罐級數(shù)的確定

種子罐的作用：使實驗室中有限數(shù)量的菌體發(fā)芽、生長并繁殖成大量菌體，接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基后能迅速生長，達到一定菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。

種子罐級數(shù)：制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，一般根據(jù)菌種生長特性、孢子發(fā)芽和菌體繁殖速度，以及所采用發(fā)酵罐的容積而定。

一級發(fā)酵：在小型發(fā)酵罐（5～30L）中進行試驗時，采用直接孢子或菌體接入罐中發(fā)酵。（二）種齡與接種量1.接種種齡：種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。過于年輕的種子接入發(fā)酵罐后，往往會出現(xiàn)前期生長緩慢，整個發(fā)酵周期延長，產(chǎn)物開始形成的時間推遲，甚至會因菌體量過少而在發(fā)酵罐內(nèi)結球，造成異常發(fā)酵的情況。過老種子會引起生產(chǎn)能力下降而菌體過早自溶。種齡以菌體處于生命力極為旺盛的對數(shù)生長期，且培養(yǎng)液中菌體量還未達到最高峰時較為合適。2.接種量接種量：移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌體繁殖到達高峰的時間，使產(chǎn)物的形成提前到來。如果接種量過多，往往使菌體生長過快，培養(yǎng)液黏度增加，造成溶解氧不足，從而影響產(chǎn)物的合成。近年來，生產(chǎn)上多以加大種子量及采用豐富培養(yǎng)基作為獲得高產(chǎn)的措施。三、菌種質(zhì)量的要求

優(yōu)質(zhì)種子必須具備下列條件：1.菌種細胞的生長活力強，移種到發(fā)酵罐后能迅速生長以縮短延滯期。2.生理性狀穩(wěn)定，以便得到穩(wěn)定的菌體生長過程。3.具有適宜的菌體總量及濃度，以滿足大容量發(fā)酵的要求。4.無雜菌污染，以確保整個發(fā)酵過程正常進行。5.保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力，使最終產(chǎn)物的生物合成量持續(xù)穩(wěn)定高產(chǎn)。第五節(jié)空氣除菌（一）空氣中微生物的分布一般寒冷的北方比暖和、潮濕的南方含菌量少；離地面越高含菌量越少，高度增加10米，微生物數(shù)量減少一個數(shù)量級；工業(yè)城市比農(nóng)村空氣中含菌量高。設計時以含量為103～104個進行計算。（二）發(fā)酵對空氣無菌程度的要求根據(jù)所用菌種的生長能力強弱、生長速度快慢、菌種分泌物的性質(zhì)、發(fā)酵周期的長短、培養(yǎng)物的營養(yǎng)成分和pH值的差異而確定。一、通氣發(fā)酵對無菌空氣的要求二、空氣除菌的方法

（一）加熱滅菌

加熱滅菌是將空氣加熱至一定溫度，并維持一定時間，殺滅空氣中的微生物的方法。（二）靜電除菌能耗低（處理1000m3耗電0.4～0.8kW.h）；空氣壓力損失少（0.1MPa左右）；對1μm塵粒的捕集效率達99%以上；設備龐大，屬高壓電技術。（三）輻射殺菌

參考相關書籍（四）過濾除菌參考相關書籍第六節(jié)微生物發(fā)酵動力學

初級代謝產(chǎn)物：微生物代謝產(chǎn)生的，并是微生物自身生長繁殖所必需的代謝產(chǎn)物。例如，氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、多糖和核酸等。次級代謝產(chǎn)物：微生物代謝產(chǎn)生的，這些代謝產(chǎn)物不是生長所必需，但可能對產(chǎn)生菌的生存有一定的價值，或者說與菌體的生長繁殖無明確關系。例如，抗生素、生物堿和色素等。一、微生物代謝產(chǎn)物類型

二、發(fā)酵操作方式

（一）分批發(fā)酵

將營養(yǎng)物和菌種一次加入發(fā)酵罐進行培養(yǎng)，直到發(fā)酵結束放出，中間除了空氣進入和尾氣排出，與外部沒有物料交換。

優(yōu)點：操作簡單，被廣泛用于多種發(fā)酵過程。

缺點：總的生產(chǎn)能力不是很高；發(fā)酵周期中非生產(chǎn)時間較長，使得發(fā)酵產(chǎn)品成本提高。

1.與生長相關聯(lián)型指微生物的比生長速度與目的產(chǎn)物的比生產(chǎn)速度正比，產(chǎn)物量與生成量同時達到最大。一般為初級代謝產(chǎn)物。例如，單細胞蛋白和葡萄糖酸、酒精發(fā)酵等，但也有微生物合成的某些酶類。

2.與生長部分相關聯(lián)型這類代謝產(chǎn)物也是來自能量代謝所用的基質(zhì)，但產(chǎn)物在菌體生長達到一定水平后開始形成，其分批發(fā)酵出現(xiàn)兩個高峰，先是出現(xiàn)基質(zhì)消耗和菌體生長的高峰，沒有或很少形成產(chǎn)物，然后是菌體生長進入靜止期，出現(xiàn)產(chǎn)物形成的高峰，即產(chǎn)物形成和菌體生長基本分開，例如，檸檬酸和某些氨基酸的發(fā)酵。3.與生長不相關聯(lián)型有些發(fā)酵過程，產(chǎn)物的形成速度與細胞的積累量有關，產(chǎn)物合成速度與菌體量成正比。這類產(chǎn)物來自兩步代謝途徑，而不是來自分解代謝途徑，在基質(zhì)消耗和菌體生長之后，菌體利用中間代謝反應來形成產(chǎn)物，初級代謝和產(chǎn)物形成完全分開，如許多抗生素的發(fā)酵。（二）連續(xù)發(fā)酵指以一定的速度向發(fā)酵罐內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同的速度流出培養(yǎng)液，從而使發(fā)酵罐內(nèi)的液量維持恒定，微生物在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。優(yōu)點：①可以維持穩(wěn)定的操作條件，有利于微生物的生長代謝，從而使產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量也相應保持穩(wěn)定。②能夠更有效地實現(xiàn)機械化和自動化，降低勞動強度，減少操作人員與病原微生物和毒性產(chǎn)物接觸的機會。③減少設備清洗、準備和滅菌等非生產(chǎn)占用時間，提高設備利用率，節(jié)省勞動力和工時。④由于滅菌次數(shù)減少，使測量儀器探頭的壽命得以延長。⑤容易對過程進行優(yōu)化，有效地提高發(fā)酵產(chǎn)率。

缺點：①由于是開放系統(tǒng)，加上發(fā)酵周期長，容易造成雜菌污染。②在長周期連續(xù)發(fā)酵中，微生物容易發(fā)生變異。③對設備、儀器及控制元件的技術要求較高。④黏性絲狀菌菌體容易附著在器壁上生長和在發(fā)酵液內(nèi)結團，給連續(xù)發(fā)酵操作帶來困難。主要應用于研究工作中，如發(fā)酵動態(tài)參數(shù)的測定、過程條件的優(yōu)化試驗等，而在工業(yè)生產(chǎn)中的應用還不多。目前連續(xù)培養(yǎng)方法在食品工業(yè)中的應用還局限于面包酵母、啤酒等的生產(chǎn)等。

（三）補料分批發(fā)酵又稱半連續(xù)發(fā)酵，是介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種發(fā)酵技術，指在微生物分批發(fā)酵中，以某種方式向培養(yǎng)系統(tǒng)補加一定物料的培養(yǎng)技術。通過向培養(yǎng)系統(tǒng)中補充物料，可以使培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物濃度較長時間地保持在一定范圍內(nèi)，既保證微生物的生長需要，又不會造成不利影響，從而達到提高產(chǎn)率的目的。

優(yōu)點：①它可以解除營養(yǎng)物基質(zhì)的抑制、產(chǎn)物反饋抑制效應。②對于好氧發(fā)酵，它可以避免在分批發(fā)酵中因一次性投入糖過多造成細胞大量生長、耗氧過多，以至通風攪拌設備不能匹配的狀況，還可以在某些情況下減少菌體生成量，提高有用產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。③在真菌培養(yǎng)中，菌絲的減少可以降低發(fā)酵液的黏度，便于物料輸送及后處理。④與連續(xù)發(fā)酵相比，它不會產(chǎn)生菌種老化和變異問題，其適用范圍也比連續(xù)發(fā)酵廣。1.單一補料分批發(fā)酵在開始時投入一定量的基礎培養(yǎng)基，到發(fā)酵過程的適當時期，開始連續(xù)補加碳源或（和）氮源或（和）其他必需基質(zhì)，直到發(fā)酵液體積達到發(fā)酵罐最大操作容積后，停止補料，最后將發(fā)酵液一次全部放出。2.反復補料分批發(fā)酵在單一補料分批發(fā)酵的基礎上，每隔一定時間按一定比例放出一部分發(fā)酵液，使發(fā)酵液體積始終不超過發(fā)酵罐最大操作容積