微生物蛋白的提取和分離純化

微生物中蛋白的分離純化用途:藥物——多肽飼料——菌蛋白工業(yè)——酶

單細(xì)胞蛋白具有較門的營養(yǎng)價(jià)值。茵體中蛋白質(zhì)可達(dá)40、60％，其中氨基酸組份齊全，生物效價(jià)較高，相當(dāng)于酪蛋白，為70左右，而且賴氨酸等必需氨基酸含量較高，還具有豐富的維生素，可以作為維生案的補(bǔ)給品。按其所發(fā)揮的功能把小肽分為兩大類,即功能性小肽和營養(yǎng)性小肽。功能性小肽指能參與調(diào)節(jié)動(dòng)物的某些生理活動(dòng)或具有某些特殊作用的小肽,如抗菌肽、免疫肽、抗氧化肽、激素肽、表皮生長因子等。營養(yǎng)性小肽是指不具有特殊生理調(diào)節(jié)功能,只為蛋白質(zhì)合成提供氮架的小肽。目前，生物界已發(fā)現(xiàn)的酶有數(shù)千種，用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的酶有上百種。工業(yè)化生產(chǎn)的酶制劑，按用途不同可分為工業(yè)用酶和醫(yī)藥用酶兩大類，前者一般不需純制品，而后者要求的純度較高，其價(jià)格是前者的數(shù)千倍至數(shù)百萬倍。由微生物生產(chǎn)的工業(yè)用酶制劑主要有糖化酶、淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、半乳糖酶、纖維素酶、蛋白酶等，醫(yī)藥用酶主要有蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、核酸酶、脂肪酶、尿激酶、鏈檄酶、天冬酰膠酶超氧化物歧化酶、溶菌酶、血溶栓酶等等蛋白質(zhì)的分離純化步驟(1)生物組織的機(jī)械破碎。(2)抽提：根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，選擇不同的溶劑進(jìn)行抽提。水溶性蛋白用中性緩沖溶液抽提，酸性蛋白用稀堿性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性劑抽提等。(3)粗提:用離心法除去固體雜質(zhì)后，可通過沉淀法、膜分離法、萃取法等處理，得到蛋白質(zhì)粗制品。(4)精制：可用層析法、電泳法進(jìn)行精制。(5)成品加工：測定蛋白質(zhì)的性質(zhì)并干燥成成品。根據(jù)所需的目的蛋白制定蛋白提取和純化的策略和步驟一般的預(yù)處理：過濾（工業(yè)生產(chǎn)）和離心（實(shí)驗(yàn)室研究）根據(jù)過濾機(jī)理的不同，過濾操作可分為澄清過濾（適合固體含量<0.1g/100ml、顆粒直徑5~100μm）和濾餅過濾（適合固體含量>0.1g/100ml）兩種。過濾操作是借助于過濾介質(zhì)，在一定的壓力差ΔP作用下，將懸浮液中的固體粒子截留，而與液體分離的技術(shù)。過濾設(shè)備：板框過濾機(jī)，真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)，錯(cuò)流過濾，硅藻土過濾機(jī)離心分離是利用轉(zhuǎn)鼓高速轉(zhuǎn)動(dòng)所產(chǎn)生的離心力，來實(shí)現(xiàn)懸浮液、乳濁液分離或濃縮的目的。根據(jù)離心原理，離心分離方法可分為：差速離心法,密度梯度離心法。差速離心法分別率不高，常用于常用于其他分離方法之前的粗制品提取和細(xì)胞器的分離。若要保持目的蛋白保持活性，則需要進(jìn)行低溫冷凍離心。預(yù)處理菌體表達(dá)的胞外酶上清（濾液）沉淀（濾餅）菌體表達(dá)的胞外酶分解培養(yǎng)基形成的小肽及一些氨基酸成分未分解利用的部分培養(yǎng)基菌體胞內(nèi)勻漿：胞內(nèi)表達(dá)的酶，小肽膜系結(jié)構(gòu)：周質(zhì)蛋白，膜蛋白細(xì)胞破碎和蛋白質(zhì)溶解機(jī)械法勻漿、研磨、壓榨、超聲等非機(jī)械法滲透、酶溶、凍融、化學(xué)等新方法激光破碎、冷凍噴射、相向流撞擊等胞外酶取預(yù)處理后的上清液（濾液），根據(jù)目的蛋白的相關(guān)性質(zhì)，采用相關(guān)的方法提取純化目的蛋白。舉例：殼聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選、產(chǎn)酶條件的優(yōu)化及殼聚糖酶的分離純化粗酶液加入50%PEG6000至終濃度為5%4℃靜置2h4000rpm離心取上清，-20℃預(yù)凍15min加入等體積-20℃的丙酮混勻，-20℃靜置2h4000rpm離心取沉淀加入少量乙醚4℃真空干燥溶于醋酸緩沖液中10000rpm冷凍離心收集上清DEAE-SepharoseFF層析(（中等堿性）陰離子交換樹脂)CM一SephaorseFF層析（（弱酸性）陽離子交換樹脂）Supedrex一75層析（分子篩柱）SDS電泳透析后濃縮調(diào)節(jié)pH至5.6Sephaery1S一200HR層析酶活檢測層析過程（1）裝柱（2）平衡（equilibrium)（3）上樣(loading)（4）洗滌(washing)（5）洗脫(elution)（6）清洗與再生離子交換柱特點(diǎn)料液處理量大，在適宜的操作條件下，分離過程具有濃縮作用；分辨率較高：優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的選擇性；所需柱長較短可在較高流速下操作；吸附作用機(jī)理明確，非特異性吸附小，產(chǎn)品回收率高；離子交換劑種類多，選樣余地大，價(jià)格也遠(yuǎn)低于親和吸附劑。層析條件——離子強(qiáng)度、pH值、流速等。主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質(zhì)。一般來說，pH對(duì)弱酸和弱堿型離子交換劑影響較大，如對(duì)于弱酸酸型離子交換劑在pH較高時(shí)，電荷基團(tuán)充分解離，交換容量大，而在較低的pH時(shí)，電荷基團(tuán)不易解離，交換容量??；同時(shí)pH也影響樣品組分的帶電性。離子強(qiáng)度增大，交換容量則下降。實(shí)驗(yàn)中增大離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫，就是要通過降低交換容量把結(jié)合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來。離子交換柱層析的操作要點(diǎn)1.平衡緩沖液

2.上樣

3.洗脫緩沖液

4.洗脫速度

要保證各個(gè)待分離物質(zhì)（如蛋白質(zhì)）的穩(wěn)定；要使各個(gè)待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合，并盡量使待分離樣品和雜質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合有較大的差別；另外注意平衡緩沖液中不能含有與離子交換劑結(jié)合力強(qiáng)的離子，否則會(huì)大大降低交換容量，影響分離效果。離子交換層析上樣時(shí)應(yīng)注意樣品液的離子強(qiáng)度和pH值，上樣量應(yīng)根據(jù)柱內(nèi)離子交換劑的交換容量決定，不宜過大，從而得到較好的分離效果。首先要保證在整個(gè)洗脫液梯度范圍內(nèi)，所有待分離組分都是穩(wěn)定的。其次是要使結(jié)合在離子交換劑上的所有待分離組分在洗脫液梯度范圍內(nèi)都能夠被洗脫下來。洗脫液的流速也會(huì)影響離子交換層析分離效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般洗脫速度慢比快的分辨率要好，但洗脫速度過慢會(huì)造成分離時(shí)間長、樣品擴(kuò)散、譜峰變寬等副作用，所以要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對(duì)集中某個(gè)區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率；如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則可適當(dāng)提高洗脫速度。洗脫按操作方式A.恒定洗脫(isocraticelution)B.分步洗脫(stageelution)C.梯度洗脫(gradientelution凝膠柱特點(diǎn)特點(diǎn)：（1）介質(zhì)不帶電荷,具有化學(xué)惰性，不與被分離物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，條件溫和，不會(huì)使物質(zhì)變性；（2）色譜介質(zhì)不需再生,可反復(fù)便用；（3）分離效率高，回收率較高；（4）廣泛應(yīng)用于生物大分子的初級(jí)分離，脫鹽等。（5）分辨率較低，需采用細(xì)長柱。（6）經(jīng)過凝膠過濾色譜后樣品被稀釋，上樣前需進(jìn)行濃縮Sephaery1S一200HR層析SephacrylHighResolution（即SephacrylHR）系列凝膠：是由烯丙基葡聚糖通過N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。凝膠的網(wǎng)孔特性由葡聚糖組分來控制，形成分級(jí)范圍不同的五種類型：S100~500HR，其中，數(shù)字越大，孔徑越大。特點(diǎn)：介質(zhì)的顆粒尺寸分布較窄，柱效高（9000塔板數(shù)/米）；在機(jī)械強(qiáng)度、理化特性、化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性等方面均優(yōu)于傳統(tǒng)凝膠介質(zhì)由于其機(jī)械強(qiáng)度高，適合在高流速下進(jìn)行快速分離；可以用0.5mol/LNaOH作為清洗劑在pH7時(shí)能承受121℃、30min反復(fù)高溫滅菌而不會(huì)對(duì)層析效果產(chǎn)生明顯影響其分離效果不受去污劑、促溶鹽類、變性劑等影響能在多種有機(jī)溶劑存在下使用Supedrex-75層析柱

Superdex系列凝膠：是將葡聚糖與高交聯(lián)度的瓊脂糖顆粒共價(jià)結(jié)合而形成的。其中，瓊脂糖基質(zhì)決定了凝膠具有高度的理化穩(wěn)定性，而葡聚糖鏈決定了凝膠的層析特性。cross-linkedagarosedextrancross-sectionfromSuperdex?particle根據(jù)分級(jí)范圍不同，可分為若干型號(hào)。其中，數(shù)字越大，孔徑越大。prepgrade顆粒較大。SuperdexpeptideSuperdex30prepgradeSuperdex75、200（prepgrade）Superdex系列凝膠是目前分辨率和選擇性最高的凝膠介質(zhì)之一顆粒尺寸很小，大小分布均勻，填充成層析柱后柱效非常高（最高可達(dá)30000塔板數(shù)/米），即使在很高的流速下仍能獲得非常高的分辨率；在機(jī)械性能、化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性等方面均大大優(yōu)于傳統(tǒng)凝膠介質(zhì)。凝膠過濾層析的操作過程1.凝膠的選擇2.裝柱3.平衡（equilibrium)4.上樣(loading)5.洗脫(elution)6.凝膠再生和保養(yǎng)平衡緩沖液應(yīng)與洗脫緩沖液相同緩沖液種類、pH、離子強(qiáng)度和添加劑的選擇應(yīng)根據(jù)溶液與基質(zhì)的相互作用、可溶性和樣品的生化性質(zhì)、以及后續(xù)操作的要求等選擇。使用前通過0.45μm的膜過濾，可防止不溶性小顆粒堵塞柱子。平衡體積至少為5倍床體積。樣品集中上樣后，加洗脫液，防