課程基因芯片2006

基因芯片及其在細胞生物學(xué)中的應(yīng)用周士新電話:828020031主要內(nèi)容1?；蛐酒母拍詈驮??；蛐酒念愋??；虮磉_的數(shù)據(jù)分析4。細胞生物學(xué)應(yīng)用實例介紹21,基因芯片的概念和原理基因芯片（genechip），又稱DNA微陣列（DNAmicroarray），是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列所形成的探針陣列，其工作的基本原理是通過雜交檢測信息,實質(zhì)是核酸堿基的互補匹配。把大量已知序列探針集成在同一個基片上，經(jīng)過標(biāo)記的若干靶核酸序列通過與芯片特定位置上的探針雜交。利用基因芯片雜交檢測圖像，可以對生物細胞或組織中大量的基因信息進行分析?；蛐酒軌蛟谕粫r間內(nèi)分析大量的基因，實現(xiàn)生物基因信息的大規(guī)模檢測。3LabeledTargetHybridizedArrayDetectionReagentsDNAMicroarray基因芯片的原理4基因芯片的相關(guān)知識

5應(yīng)用原則基因表達的微陣列應(yīng)用最為廣泛是比較試驗為了提高實驗的可靠性，對于同一樣本，往往有兩次或更多次的重復(fù)實驗;由于DNA微陣列的費用較貴，不可能重復(fù)足夠多的次數(shù)來滿足實驗數(shù)據(jù)分析的要求良好的模型(除比較因素外,其他盡量相同)，時間點的選擇適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計方法來分析數(shù)據(jù)62,基因芯片的類型探針制備方法：

1.cDNAarrays(Microspotting)cDNA芯片 2.Oligonucleotidearrays(Photolithographicsynthesis,Ink- jettechnology,etc.)寡核苷酸芯片探針位置:

基因表達芯片(geneexpressionmicroarray)

啟動子芯片(promotermicroarray)CHIP(染色質(zhì)免疫共沉淀)onchip

外顯子（exons

microarray）

基因組芯片（Tilingmicroarray）

7基因芯片的類型探針用途：轉(zhuǎn)錄因子、免疫分子、細胞周期等腫瘤相關(guān)：Oncogene芯片、抑癌基因芯片microRNA芯片DNA甲基化芯片

8對遺傳過程的認(rèn)識,2004ProteinhnRNADNAtr

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ntranslationMoleculeswitheffectorfunctiontRNArRNAreversetranscriptionmRNAsplicingribozymesmiRNAdicingpre-miRNAOthernoncodingRNAs9基因組序列基因表達譜蛋白質(zhì)譜mRNA編輯表觀遺傳機制轉(zhuǎn)錄過程染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA甲基化轉(zhuǎn)錄因子表達譜轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列的差異DNA結(jié)合RNA可變剪切MicroRNAs10Oligo(寡核苷核)芯片Oligo(寡核苷核)芯片介紹公司(美國Affymetrix)推動主要特點是超高密度核苷酸長度較短(=<60nt)11Affymetrix光脫保護合成法LampMaskChip12O

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GMaskSubstrateMaskSubstrateT–C–REPEATAffymetrix光脫保護合成法13Affymetrix光脫保護合成法Eachprobe25bplong11-20probespergenePerfectMatch(PM)aswellasMisMatch(MM)probes14Affymetrix基因表達芯片的探針設(shè)計5’3’mRNAsequencePerfectMatchMismatch15Affymetrix基因芯片流程SpecimensBioinformaticsLabeledTargets000016PMMMProbePairProbeCell:-24mmx24mm-3mm/Pixel-64PixelsAffymetrix探針設(shè)計17cDNAProbesGenBankUniGenedbESTcDNAArrays(~10,000Probes)RoboticPrintingcDNA基因芯片18ControlTestRT&LabeledwithFluorDyescDNAMicroarraysscanningCy3Cy5BioinformaticscDNA基因芯片樣品標(biāo)記19cDNA基因芯片的熒光信號20Oligonucleotide芯片與cDNA芯片的比較OligonucleotideArrays

cDNAArraysHighdensity LowerdensityHighspecificity

Cross-hybridizationcannotbe determinedRequiressmallamountofsamples LargeramountofsamplesisrequiredGeneexpressionand MostlyforGeneExpressionGeneticalteration/polymorphismHighreagentcosts LowerreagentcostsHybridizationoftargetfromasinglesource Simultaneoushybridizationoftargets fromtwosourcesClonesforsignalvalidationhavetobe Clonesavailableforsignalvalidation

obtainedfromothersourcesDifficulttomanufacturearraysin-house

Arraymanufactureislaborintensive andinitialset-upisexpensiveHighcostperarray LowcostperarrayLowerflexibility Highflexibility21基因表達芯片cDNAArraysOligonucleotideArraysGlasArraysMembranebasedArrays22圖像分析網(wǎng)格Gridding:identifyspots(automatic,semiautomatic,manual)分割Segmentation:separatespotsfrombackground.Fixedcircle(B),AdaptivecircleC,Adaptiveshape(D),Histogram強度提取Intensityextraction:meanormedianofpixelsinspot背景修正Backgroundcorrection:localorglobal23啟動子芯片簡介染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatinimmunoprecipitation,ChIP）技術(shù)該技術(shù)的主要方法是：將細胞先用甲醛固定，使DNA和蛋白質(zhì)交聯(lián)，再用DNA結(jié)合蛋白（轉(zhuǎn)錄因子和核酸結(jié)合酶類）的特異性抗體將蛋白質(zhì)和DNA一起沉淀下來，與蛋白質(zhì)解離后的DNA經(jīng)過PCR擴增，并用熒光標(biāo)記后，與芯片上的核酸探針雜交，通過雜交信號的檢測，判定該DNA結(jié)合蛋白與何種基因結(jié)合，由于DNA結(jié)合蛋白通常與基因的啟動子區(qū)結(jié)合，也稱為啟動子區(qū)基因芯片。

2425Tilingmicroarray簡介26Unbiased尋找轉(zhuǎn)錄因子的位點(TFBS)27Miskaetal.2005currentopinioningenetics

microRNA基因芯片簡介2829MicroarrayofmicroRNA30VisualizationofmiRNAarray313,基因芯片的數(shù)據(jù)分析DataProcessingDataMiningInformationDataKnowledge32數(shù)據(jù)處理NormalizationBackgroundSubtractionExpressionAlgorithmIntensityAlgorithmDataProcessing33基因表達數(shù)據(jù)分析過程強度算法(IntensityAlgorithm)將圖像轉(zhuǎn)化為雜交信號值背景去除(BackgroundSubtraction)

去除非特異性的雜交信號(背景信號)探針的對應(yīng)算法(ExpressionAlgorithm)將探針的雜交信號值與各自所代表的基因相對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化(Normalization)不同試驗和不同樣品間數(shù)據(jù)的歸一化,使它們均衡可比34數(shù)據(jù)挖掘DataMiningGenesExperimentsNovelgenesNovelfunctionsofknowngenesPathwayelucidationsBiologicalProcesses123456-1.5-0.50.51.5123456-1.5-0.50.51.5123456-1.5-0.50.51.5123456-1.5-0.50.51.535主成分分析PrincipalComponentAnalysis(PCA)

分層聚類分析HierarchicalClusterAnalysis(HCA)

MultidimensionalScaling(MDS)

k-Means

ClassificationandRegressionTree(CART)

自組織映射Self-OrganizingMaps(SOM)

相關(guān)系數(shù)聚類CorrelationCoefficientClustering

向量機SupportVectorMachine(SVM)

k最近鄰法k-NearestNeighbors(KNN)

PartialLeast-SquaresRegression(PLS)

Back-PropagationArtificialNeuralNetwork(BP-ANN)

GeneticAlgorithm(GA)數(shù)據(jù)挖掘的方法介紹36a,hierarchicalclustering;b,Self-organizingmaps(SOMs)d,principalcomponentanalysis(PCA);e,nearest-neighborhoodmethod37LeukemiamelanomabreastcancercoloncancerScherfetal.NatureGenetics24:236-244(2000)

cDNAmicroarray9703cDNAprobes人類腫瘤的基因表達譜(PCA分析)38ResearchProjects分層聚類分析39Alizadehetal.,Nature403:503-11,2000404,基因芯片應(yīng)用實例3.Extractmetylationpatternandinterpretresults41基因表達的時間性及空間性

(temporalandspatialspecificity)時間特異性