蛋白質(zhì)分離純化基礎(chǔ)技術(shù)培訓(xùn)20140429

蛋白分離純化基礎(chǔ)知識

蛋白質(zhì)的分離純化是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成和生物功能的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)在自然界中存在于復(fù)雜的混合體系中，而且許多重要的蛋白質(zhì)在細胞中的含量極低。要把蛋白質(zhì)從復(fù)雜的體系中分離出來，同時又要防止其組成、結(jié)構(gòu)的改變和生物活性的喪失，顯然是有相當(dāng)難度的。概述破碎蛋白溶解酸、堿醇去垢劑尿素……粗提沉淀相分離分子篩……精提各種色譜電泳分離差速離心……研磨超聲滲透壓酶……保存原材料的獲取濃縮保存狀態(tài)保存條件保存期限……培訓(xùn)內(nèi)容蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理蛋白質(zhì)常規(guī)層析技術(shù)FDA關(guān)于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定培訓(xùn)內(nèi)容蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理蛋白質(zhì)常規(guī)層析技術(shù)FDA關(guān)于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定預(yù)處理液體材料過濾離心固體材料洗滌材料破碎破碎方法機械破碎非機械破碎攪拌、振動研磨壓濾超聲勻漿干燥滲透壓凍融酶超聲破碎頻率高于20000HZ的聲波稱為“超聲波”。缺點：發(fā)熱，剪切力強，體系中會產(chǎn)生自由基，它可能破壞蛋白的結(jié)構(gòu)。滲透壓破碎滲透沖擊法破碎E.Coli表達產(chǎn)物的抽提以滲透沖擊法為宜，沒有特殊原因不要使用超聲破碎法。不破壞細胞壁，改變細胞膜的通透性。0°C，20%蔗糖，10mM左右緩沖液，含2.5mMEDTA，高滲后，加入低滲液，迅速充分懸浮。如果必要，應(yīng)含DTT至2mM左右；均漿液組成原則：離子強度盡量低：≤50mM，有時需DTT，不一定加EDTA，可考慮加PMSF，但此時不宜用Tris等胺類緩沖劑離心離心是利用離心力，分離液體與固體顆?；蛞后w與液體的混合物中各組分的方法。是根據(jù)物質(zhì)顆粒的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度及浮力等因子的不同，而使物質(zhì)分離的技術(shù)。不同細胞結(jié)構(gòu)分離所需的離心力結(jié)構(gòu)離心力g細胞核800-1000線粒體20,000-30,000葉綠體20,000-30,000溶菌酶20,000-30,000微體20,000-30,000粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)50,000-80,000質(zhì)膜和光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)80,000-100,000cytosolic>100,000游離核糖體、病毒粒體150,000-300,000離心方法差速離心、等密度梯度離心、速率區(qū)帶密度梯度離心平衡等密度梯度離心區(qū)帶離心連續(xù)流離心。。。離心優(yōu)點操作簡單，成本較低缺點沉淀的蛋白因為擠壓、變性、聚集而失活不適合大規(guī)模操作超濾分子量cutoff的含義如膜對被截留物質(zhì)的截留率大于90％時，就用被截留物質(zhì)的分子量表示膜的截留性能，稱為膜的截留分子量。超濾超濾由于剪切力和發(fā)熱的影響，易造成蛋白失活。如果用超濾分離蛋白，只有分子量相差一個數(shù)量級才可以分開在蛋白濃度低的情況下，超濾膜對蛋白的吸附比較強。可以用Tween20先鈍化，能降低蛋白吸附雙水相系統(tǒng)：因兩種水溶性聚合物的水溶液，或一種水溶性聚合物水溶液與鹽溶液混合時的不相容性而形成有明顯界面的兩相系統(tǒng)雙水相抽提

葡聚糖（Dextran）與聚乙二醇（PEG）按一定比例與水混合，溶液混濁，靜置平衡后，分成互不相溶的兩相，上相富含PEG、下相富含葡聚糖各種類型的雙水相體系類型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非離子型聚合物/非離子型聚合物聚乙二醇葡聚糖聚乙烯醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮高分子電解質(zhì)/非離子型聚合物羧甲基纖維素鈉聚乙二醇高分子電解質(zhì)/高分子電解質(zhì)葡聚糖硫酸鈉羧甲基纖維素鈉聚合物/低分子量化合物葡聚糖丙醇聚合物/無機鹽聚乙二醇磷酸鉀硫酸銨特點：兩相均含有大量的水（高達80%以上），界面張力小，一般只有0.5-10-4mN/m，萃取環(huán)境和條件溫和，生物相容性好，有時有穩(wěn)定作用；分配系數(shù)可控：聚合物修飾、相系統(tǒng)組成

操作條件容易放大幾百倍。選擇雙水相的原則能夠獲得高的產(chǎn)物回收和生物活性回收，高的分離純化倍數(shù)；系統(tǒng)的物理化學(xué)性質(zhì)有利于大規(guī)模的應(yīng)用，有良好的工藝性能，系統(tǒng)黏度低，相分離快，達到相平衡時間短，工藝參數(shù)容易控制，工藝條件可調(diào)性范圍大；系統(tǒng)經(jīng)濟，成本低，無毒，適合大規(guī)模應(yīng)用。優(yōu)點直接從cell碎片勻漿中萃取prot、而無需將細胞碎片分離雙水相系統(tǒng)平衡時間短，含水量高，界面張力低，成相聚合物對蛋白質(zhì)有穩(wěn)定作用，為生物活性物質(zhì)提供了溫和的分離環(huán)境操作簡便，經(jīng)濟省時，易于放大.由于很容易達到平衡，用商業(yè)上的離心機能使相分離完全，分配系數(shù)的值重演性很好，故可直接放大改變體系的pH和電解質(zhì)濃度可進行反萃取通常將蛋白質(zhì)分配在上相，而細胞碎片分配在下相（鹽）缺點雙水相技術(shù)雖然在生物物質(zhì)分離中有其獨特的優(yōu)點，但雙水相萃取技術(shù)體系并不完善，有很多需要解決的問題，其中很主要的一個是萃取劑的回收。在生物分子回收和純化以后，怎樣從含有目標(biāo)產(chǎn)物殘留物水溶液中回收聚合物和鹽就成為重要問題。目前聚合物的回收采用的一些方法是：超濾、滲析膜過濾離子交換吸附，但這些方法都存在自身缺點，不能使聚合物很完全的回收，仍然使成本較高。雙水相萃取技術(shù)雖然有技術(shù)的優(yōu)勢，但其原料成本較高，使其產(chǎn)業(yè)化成了問題。另外，雙水相萃取技術(shù)至今還沒有一套完善的理論體系，不能很好的解釋大分子在體系中分配的機理。培訓(xùn)內(nèi)容蛋白質(zhì)樣品的預(yù)處理蛋白質(zhì)常規(guī)層析技術(shù)FDA關(guān)于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的重要規(guī)定層析的概念流動相流出組分固定相洗脫峰例如葡聚糖凝膠、纖維素、樹脂等層析介質(zhì)生物兼容性：親水性，大孔徑，不會使生物大分子失活，沒有生物化學(xué)毒性—過強吸附、泄露?；瘜W(xué)穩(wěn)定性：在生物大分子存在的化學(xué)條件下是穩(wěn)定的。必要的機械性能：流體中的耐壓性、彈性。層析前需要了解蛋白質(zhì)純化表蛋白質(zhì)含量、目標(biāo)活性的含量、比活性、純化倍數(shù)、活性回收率、產(chǎn)率等需要關(guān)注過程相關(guān)雜質(zhì)或污染物明確關(guān)鍵雜質(zhì)，哪一步去除了哪些雜質(zhì)，體現(xiàn)質(zhì)量源于設(shè)計綜合考慮樣品的各種性質(zhì)穩(wěn)定性、等電點、分子量、疏水性、產(chǎn)品濃度純化經(jīng)濟學(xué)一般3步到4步純化，步驟如果再多，可能不經(jīng)濟常用層析技術(shù)親和層析離子交換層析疏水層析凝膠過濾層析親和層析原理：

親和層析是利用生物高分子與配基可逆結(jié)合的原理，將配基通過共價鍵結(jié)合于載體上而制得的層析系統(tǒng)。這種可逆結(jié)合的作用主要是靠生物高分子對它的配基的空間結(jié)構(gòu)的識別。常用的生物親和關(guān)系有酶-底物、抗體-抗原、外源凝集素-糖蛋白等。

親和層析純化過程簡單、迅速，且分離效率高。對分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)尤為有效。但本法必須針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此親和層析的應(yīng)用范圍受到了一定的限制。原理：

以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組