腫瘤的分子診斷

腫瘤的分子診斷

器官病理學組織病理學細胞病理學免疫病理學分子病理學

應用分子診斷技術，對腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理學機制及生物學行為能從分子水平上加以認識，其范圍覆蓋分子生物學和細胞生物學。研究較為深入當屬癌基因、抑癌基因及其它相關基因。

第一節(jié)

腫瘤基因過表達及其檢測

一、基因過表達的形式

癌基因一般為單拷貝基因，有其編碼的蛋白質(zhì)，在腫瘤細胞內(nèi)的一些癌基因在DNA復制過程中形成多個拷貝，形成雙微粒染色體和均染區(qū)，各種基因的擴增常產(chǎn)生基因產(chǎn)物過表達，表現(xiàn)為RNA和蛋白質(zhì)量的增加。二、基因過表達的檢測

（一）表達產(chǎn)物的檢測免疫組織化學（immunohistochemistry）酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA

）蛋白印跡（Westernblot）流式細胞儀測試法

（二）基因擴增的檢測

基因拷貝數(shù)的增加和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的mRNA的增加分子診斷檢測方法:

原位雜交（insituhybridization,ISH）

熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridization,FISH）

原位PCR（insitupolymerasechainreaction）

Southern雜交（DNA雜交）

Northern雜交（RNA雜交）

原位雜交（insituhybridization,ISH）將分子雜交與組織化學相結合的一項技術，屬固相核酸分子雜交范圍，它用標記的DNA或RNA為探針在原位檢測組織細胞內(nèi)特異的DNA或RNA序列。優(yōu)點：1、具有分子雜交的特異性強、靈敏高特點，同時又具有組織細胞化學染色的可見性；2、即可用新鮮組織，又可用石蠟包埋組織作回顧性研究；3、所需樣本量少，可用活組織細針穿刺和細胞涂片；4、應用范圍廣泛，可對特定的基因（如癌基因、病毒基因）DNA、mRNA的表達進行定位、定性和定量。組織細胞分布和雜交電鏡的亞細胞定位研究。分類：DNA-DNA雜交DNA-RNA雜交RNA-RNA雜交直接法間接法同位素標記非同位素標記生物素、地高素、熒光素等雙重標記原位雜交技術

熒光原位雜交（FISH）將熒光素標記克隆的DNA片段與染色體或細胞間期染色質(zhì)雜交，以測試該特定的DNA片段是否有缺失或擴增。比較基因組雜交（comparativegenomehybridizationCGH）即將熒光素分別標記在去除了重復序列的腫瘤及正常細胞基因組DNA上，然后分別與正常染色體進行原位雜交，對該二種不同探針與各個染色體雜交后的信號進行比較，以了解該腫瘤中細胞在不同染色體上缺失或擴增的狀態(tài)。原位PCR（insitupolymerasechainreaction）將PCR擴增技術和原位雜交技術相結合，通過PCR技術對靶核苷酸序列在染色體上或組織細胞內(nèi)進行原位擴增使基因拷貝數(shù)放大，再通過原位雜交方法檢測，以達到對靶核苷酸進行定性、定位、定量分析。一種敏感性高、特異性強，能在組織細胞原位進行低拷貝數(shù)基因定性的研究方法。Southern雜交：一種DNA特定序列定位技術。以組織或細胞中獲取基因組DNA，用一種或多種限制性內(nèi)切酶酶切，通過電泳、轉(zhuǎn)印、原位變性固定于一固相支持物，用已標記的特異性DNA或RNA的探針與固定有DNA的固相支持膜雜交，經(jīng)過放射自顯影或化學發(fā)光自顯影，對顯影條帶進行分析。Northernblot：用于分析細胞總RNA或含有polyA尾的RNA樣品中特定mRNA分子大小和豐度的分子雜交技術，可了解被測靶基因在細胞內(nèi)有無過表達。

注意問題：1、提取組織或細胞中的RNA，不需酶切而直接采用電泳。2、操作過程要嚴格控制RNase的污染。3、RNA只與雙鏈DNA樣本中的一條鏈互補，因此雜交時所需雙鏈DNA探針的量加大；如采用單鏈探針，無論是DNA抑或RNA探針，或是寡核苷酸探針，均需確定所用探針能與目標RNA互補。第二節(jié)

基因突變及其檢測癌基因和抑癌基因突變是腫瘤發(fā)生中出現(xiàn)頻率較高的分子事件，突變的結果則使癌基因激活或抑癌基因失活，導致細胞表型發(fā)生變化和腫瘤發(fā)生?；蛲蛔兪且粡碗s的過程，不僅在腫瘤細胞中檢測到突變基因，對于某些癌前病變或癌前狀態(tài)的組織細胞中也存在不同形式和不同程度的基因突變，在同一腫瘤的不同發(fā)展階段，可能會涉及多種基因不同形式的突變，說明腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與、多步驟的復雜的生物學過程。一、基因突變的形式點突變（pointmutation）基因缺失(genelosses)

基因異位或重排

（genetranslocationandrearrangment）（一）點突變（pointmutation）指基因在特異位置發(fā)生一個核苷酸的改變，使相應蛋白質(zhì)的一個氨基酸改變，繼而改變了蛋白質(zhì)的空間構型和生物學功能。

錯義突變（missence）

無義突變（nonsence）

終止碼突變（stopcodon）

移碼突變（frameshift）等（二）基因缺失(genelosses)

基因片段缺失是另一種主要的突變形式，缺失的范圍差別較大，可以是1-2個堿基，也可以是一個片段甚或一個外顯子的缺失。基因片段的缺失可使該基因激活，轉(zhuǎn)錄異常，使基因正常的生物學功能喪失。基因缺失與腫瘤的臨床病理及生物學行為密切相關?；蛉笔е休^為頻發(fā)的分子事件是存在于抑癌基因中的等位基因雜合型和純合型丟失?；蛉笔悄[瘤形成的原因還是細胞惡性轉(zhuǎn)化的結果，尚值得深入探討。（三）基因異位或重排

（genetranslocationandrearrangement）某一基因在腫瘤細胞中從染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到其它染色體的某個位置上稱為易位或重排。易位與重排易使癌基因被激活，或是抑癌基因失活，從而使細胞惡變。細胞癌基因的編碼序列在DNA分子上是不連續(xù)的，由內(nèi)含子分隔，其中有些序列起到促進子和調(diào)節(jié)基因的作用，如染色體出現(xiàn)易位、重排等改變時，可使細胞癌基因于正常的抑制子分開而被置于活化DNA序列的控制之下，其中具有代表性的例子為Burkitt淋巴瘤。(四)其它類型的基因突變插入甲基化染色體非組蛋白改變等

癌基因或抑癌基因甲基化（methylation）狀態(tài)改變與腫瘤發(fā)生存在密切關系。二、基因突變的檢測方法目前幾乎所有的基因突變檢測的分子診斷技術都是建立在PCR的基礎上，由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn)，自動化程度越來越高，分析時間大大縮短，分析結果的準確性也有了很大提高。（一）PCR-SSCP法單鏈構像多態(tài)性

(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)

基本原理：

單鏈DNA在中性條件下會形成二級結構，這種二級結構依賴于其堿基組成，在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其堿基序列不同而形成不同構象，一個堿基的改變將影響其構象而導致其在凝膠上移動速度改變，不同的二級結構而出現(xiàn)不同的遷移象。該法不能測定突變的準確位點，還需通過序列分析來確定。對于大于200bp的片段，用其RNA分子來做SSCP會提高其靈敏度。該法簡單快速，被廣泛用于未知基因突變的檢測。由于該法的簡便快速，特別適合大樣本基因突變研究的篩選工作。應用PCR-SSCP檢測點突變已見報道于人類大部分的腫瘤組織或細胞，檢測的基因包括多種癌基因及抑癌基因，也是檢測抑癌基因p53突變最常用的方法。（二）雜合雙鏈分析法

（heterodulexanalgsis,HA）

直接在非變性凝膠上分離雜交的突變型-野生型DNA雙鏈。由于突變型和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯配處會形成突起，在非變性凝膠中電泳時，會產(chǎn)生與相應同源雙鏈DNA不同的遷移率。HA對一些不能用SSCP檢出的突變有互補作用，二者結合使用，可使突變檢出率提高近100%。

（三）突變體富集PCR

（mutant-enrichedPCR）利用癌基因或抑癌基因某個編碼子部位存在已知的限制性內(nèi)切酶位點，用連續(xù)二次的巢式PCR來擴增包括存在酶位點編碼子的DNA片段，在兩次擴增反應之間用相應的內(nèi)切酶消化擴增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進入第二次PCR擴增，而突變型則能完整進入第二次PCR擴增并得到產(chǎn)物的富集。（四）變性梯度凝膠電泳法

（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）雙鏈DNA在變性梯度聚丙烯酰胺凝膠中電泳，凝膠中自上而下所含變性劑濃度線性增長，DNA片段進行到變性劑某一濃度，與DNA變性溫度一致的凝膠位置時，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳遷移率下降，但解鏈的DNA鏈中有一個堿基改變時，會在不同時間解鏈，則因影響電泳速度變化的程度而被分離。在DGGE基礎上，又發(fā)展了用溫度梯度代替化學變性劑的TGGE法（temperaturegradientgel

electrophoresis,TGGE），由于DGGE和TGGE是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，均需專用的電泳裝置。（五）化學切割錯配法

（Chemicalcleavageofmismatch,CCM）

基本原理：將待測含DNA片段與相應的野生型DNA片段或RNA片段混合變性雜交，在異源雜合的雙鏈核酸分子中，錯配的C能被羥胺或哌啶切割，錯配的T能被四氧化鋨切割，經(jīng)變性凝膠電泳可確定是否存在突變。該法檢出率很高，也是檢測片段最長的方法。應用熒光檢測系統(tǒng)可增強敏感度。該法中的化學試劑有毒，故又發(fā)展了碳化二亞胺檢測法（Carbodiimide，CDI），CDI為無毒物質(zhì)。（六）等位基因特異性寡核苷酸分析法(allele-specificoligonucleotideASO)

設計一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，以此為探針，與固定在膜上的經(jīng)PCR擴增的樣品DNA雜交。可以選用各種突變類型的寡核苷酸探針，同時以野生型探針為對照，如出現(xiàn)陽性雜交帶，則表示樣品中存在與該ASO探針相應的點突變。（七）DNA芯片技術（DNAChip）

基本原理：

將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在一塊固體材料如玻璃片、硅片（集成電路板）上，彼此之間重疊一個堿基，并覆蓋所需測定的基因，將熒光標記的正常DNA和突變DNA分別與兩塊DNA芯片雜交，由于至少存在一個堿基的差異，正常和突變的DNA將會得到不同的雜交圖譜，經(jīng)過共聚焦顯微鏡分別檢測兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號，即可確定是否存在突變。可用于基因定位、DNA測序、物理圖譜和遺傳圖譜的構建等，在基因突變檢測方面DNA芯片也有廣闊的前景。（八）RNA酶A切割法制備RNA探針，與待測DNA或RNA片段雜交，在一定條件下，異源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA的錯配堿基可被RNaseA切割，切割產(chǎn)物可通過變性凝膠電泳分離。該法可用于1-2kb的大片段進行檢測，并能確定突變位點。（九）染色體分析（analysisofchromosome）

1、熒光原位雜交技術（FISH）2、寡核苷酸引物原位DNA合成技術（OligonncleotideprimedinsituDNAsynthesis,PRINS）

重復引物原位標記技術（repeatedPRINS）

多色原位引物標記（multicolorPRINS）

3、比較基因組雜交

（comparativegenomichybridization,CGH）

基本原理：用不同的非同位素標記物，分別標記被檢測的基因組DNA（常為腫瘤DNA）和正常人基因組DNA，兩者以1：1混合后制備探針，共同與正常人中期染色體標本進行染色體原位抑制雜交，雜交后對不同熒光物分別進行檢測，以每條染色體長軸各位點的被測DNA與正?；蚪MDNA熒光強度比，反映兩組DNA不同序列的拷貝數(shù)。只能檢測腫瘤基因組中相對于正?；蚪M平均拷貝數(shù)的變化，而不能檢測易位、倒位及其它拷貝數(shù)沒有變化的染色體畸變，基因重排和點突變，也不能檢出小于2Mb的缺失。

（十）DNA序列分析（DNAsequencing）應用各種突變檢測技術檢測到的基因突變，最后都需要用DNA序列分析才能確定突變的類型及突變的位置。

直接測序法（directsequencing，DS）

PCR循環(huán)測序法

雙脫氧終止法基本原理

第三節(jié)

限制性酶切片段長度多態(tài)性分析

一、等位基因不平衡應用同一腫瘤的正常體細胞（常分為血細胞或腫瘤旁正常組織）和腫瘤細胞的DNA，檢測DNA多態(tài)性座位上等位基因不平衡性。當兩個等位基因的相關性密度在正常與腫瘤細胞之間出現(xiàn)顯著性差異時，就提示腫瘤細胞中多態(tài)序列座位處出現(xiàn)突變。限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）當DNA序列的差異發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點，或當DNA片段的插入、缺失或重復，可使基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶水解后發(fā)生片段長度改變。因為這些特異基因片段是限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的，在不同個體間可出現(xiàn)不同長度的限制性片段類型，故稱為限制性片段長度多態(tài)性RFLP的研究可以觀察到同一患者的正常細胞DNA中存在二個等位基因，而腫瘤