第3單元 免疫凝集類實驗

第三單元免疫凝集類實驗

驗證實驗一直接凝集實驗顆粒性抗原與相應抗體直接反應，在適當電解質參與下出現(xiàn)的肉眼可見的凝集現(xiàn)象。常用的試驗方法有玻片凝集法和試管凝集法。本實驗以試管法凝集試驗——肥大試驗（Widaltest）驗證凝集反應及其特點。

Widaltest原理

將已知的顆粒性抗原（傷寒沙門菌）定量加入到系列倍比稀釋的待測血清中，根據(jù)各血清稀釋度凝集情況，測定血清中有無相應抗體及其相對含量。實驗器材和材料器械

試管、吸管、恒溫水浴箱等試劑

抗體待測傷寒沙門菌免疫血清、抗原傷寒沙門菌診斷菌液（7×108/ml)、生理鹽水實驗方法（Widaltest）

取試管7支，依次編號并做好標記。每支試管中加生理鹽水0.5ml。倍比稀釋血清：

取1∶20稀釋的待測血清0.5ml加入到第1管，混勻后吸取0.5ml加入到第2管，如此連續(xù)稀釋至第6管，混勻后吸取0.5ml棄去；第7管不加血清作為陰性對照。

加診斷菌液：

每管加傷寒沙門菌H或O診斷菌液0.5ml，此時各管血清最終稀釋度依次為1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560搖勻后置37℃水浴2～4h，取出觀察結果或放室溫過夜，次日觀察結果。試管凝集法操作程序試管號1234567生理鹽水（ml)0.50.50.50.50.50.50.5待測血清（ml)0.50.50.50.50.50.5傷寒O菌液(ml)0.50.50.50.50.50.50.5血清稀釋度1:801:1601:3201:6401:12801:25600.50.50.50.50.5棄掉0.5結果

1234567菌液試管凝集試驗原理

結果判斷實驗結果 將試管置于有良好光源和黑色背景下，觀察管底凝集物的范圍和上清液的濁度，記錄凝集程度，判斷凝集效價用++++、+++、++、+、-等符號記錄凝集效價。對照管：應無凝集現(xiàn)象試驗管：“++++”：上清液澄清，細菌全部凝集，凝集塊全部沉于管底

“+++”：上清液稍混濁，細菌大部分凝集并沉于管底

“++”：上清液較混濁，約50%的細菌凝集并沉于管底

“+”：上清液混濁，僅少量細菌凝集

“-”：不凝集，液體濁度與對照管相同血清抗體效價：試驗管出現(xiàn)“++”以上的凝集現(xiàn)象即可判斷為陽性；以出現(xiàn)“++”凝集的最高血清稀釋度為該待測血清的抗體效價。注意事項凝集反應只有在抗原抗體比例適當時，才能出現(xiàn)肉眼可見的反應一般情況下，隨著血清濃度的逐漸稀釋，凝集反應越來越弱，但在抗體濃度過高時，反而無凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，此為前帶現(xiàn)象，出現(xiàn)該情況時，須加大抗體稀釋倍數(shù)重新試驗。直接凝集試驗也可以用玻片法以鑒定傷寒沙門菌為例：取潔凈載玻片2張，在玻片的左上角分別標明“1”、“2”；加入已知抗體（傷寒沙門菌診斷血清）和待測菌液（傷寒沙門菌或其他細菌）。1生理鹽水

+傷寒桿菌

1:40傷寒桿菌診斷學清

+

傷寒桿菌2生理鹽水

+大腸桿菌

1:40傷寒桿菌診斷學清

+

大腸桿菌玻片凝集試驗鑒定傷寒沙門菌

玻片凝集試驗(slideagglutinationtest)顆粒性抗原與相應抗體直接結合

出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象

在玻片上YYY+

？Y+

將載玻片置黑色背景上觀察。在診斷血清中，混懸液由混濁變澄清并出凝集物，則為陽性結果；混懸液仍為勻混濁的乳狀液，則為陰性結果。肉眼觀察不夠清晰者，可在低倍鏡下觀察。

結果分析實驗討論肥大試驗是一種經(jīng)典的半定量試管凝集試驗。在臨床上主要用已知的傷寒沙門菌O或H抗原檢測血清中有無相應的特異性抗體及其效價，以協(xié)助診斷傷寒病或供流行病學調(diào)查。凝集反應只有在抗原抗體比例適當時，才能出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。臨床上開展的外斐反應是利用與立克次體有共同耐熱性多糖抗原的變形桿菌OX19、OX2、OXk菌株代替立克次體作為已知抗原，與患者血清進行凝集試驗，以輔助診斷斑疹傷寒、恙蟲病等立克次體疾病?，F(xiàn)有OX19、OX2、OXk三種診斷菌液和待測血清，請寫出利用試管凝集法進行的外斐試驗的操作步驟。思考題為什么臨床上不直接利用立克次體作為已知抗原進行血清學診斷呢？

驗證實驗二間接凝集實驗

間接凝集實驗（indirectAgglutinationTest)

將可溶性抗原（或抗體）先吸附于一種與免疫無關、大小均勻的惰性載體顆粒表面，使其成為致敏載體，然后再與相應抗體（或抗原）結合，在適當電解質存在的條件下，載體顆粒被動地發(fā)生凝集，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。

以膠乳凝集試驗檢測類風濕因子（rheumatoidfactor,RF）為例驗證間接凝集實驗的原理和特點

實驗原理

類風濕因子（RF）是一種抗變性IgG的自身抗體，具有與人或動物變性IgG結合的特點。將處理過的人IgG與聚苯乙烯膠乳顆粒結合成致敏顆粒，當待測血清中含有RF時，則與致敏顆粒上變性的IgG發(fā)生反應，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。膠乳顆粒人IgG致敏致敏膠乳NS凝集顆粒待測RF實驗器材

器械 黑色方格反應板、毛細滴管、試管、試管架、吸耳球、恒溫水浴箱等試劑 人IgG致敏膠乳試劑（市售類風濕因子檢測試劑） 類風濕因子陽性血清和陰性血清：臨床標本篩選獲得

待測血清

實驗方法

待測血清、陽性血清、陰性血清分別用生理鹽水作1∶20稀釋。在黑色方格反應板上取3個格，用毛細滴管分別滴加稀釋待測血清、陽性血清、陰性血清各1滴，然后每格加入人IgG致敏膠乳試劑1滴。連續(xù)輕輕搖動反應板，2～3分鐘后觀察結果。結果判斷

若膠乳顆粒凝集且液體澄清者為陽性反應膠乳顆粒不凝集仍保持均勻膠乳狀者為陰性反應注意事項試劑應4℃保存，嚴禁凍結，用時搖勻；所有試驗器皿和反應板均應洗凈、干燥；若陰性對照出現(xiàn)凝集，則表示致敏乳膠試劑有質量問題，不能使用。實驗結果分析和討論膠乳凝集試驗方法簡便、快速，但易發(fā)生非特異性凝集反應，試分析如何判定實驗的非特異性凝集反應。判斷凝集或凝集程度除目測外，是否還有其他方法？驗證實驗三間接凝集抑制實驗概念間接凝集抑制試驗（indirectagglutinationinhibitiontest）是以抗原致敏的載體及相應抗體作為診斷試劑，用于檢測標本中是否含有與致敏抗原相同的抗原的試驗。檢測時先將抗體試劑與待測標本混合，再加入抗原致敏的載體。若標本中沒有與抗體試劑相對應的抗原，則抗體試劑與隨后加入的致敏載體上的抗原結合而出現(xiàn)凝集；若標本中存在與抗體試劑相對應的抗原，抗體先與之結合，隨后加入的致敏載體上的抗原則無抗體結合，凝集反應被抑制。本實驗以檢測尿絨毛膜促性腺激素（HCG）的妊娠免疫診斷試驗為例進行膠乳凝集抑制現(xiàn)象的觀察和驗證。實驗原理

孕婦尿液中含有HCG，正常人尿中無HCG。當向孕婦尿中加入一定量抗HCG抗體時，尿HCG即與抗HCG發(fā)生抗原抗體反應，此時，再加入膠乳抗原（吸附有HCG的聚苯乙烯膠乳顆粒），因抗體被消耗，故不能發(fā)生凝集，即凝集被抑制，為凝集抑制試驗陽性；反之，若待檢尿中無HCG（非妊娠尿），則加入的抗HCG抗體未被結合和消耗，可與隨后加入的乳膠抗原發(fā)生反應，出現(xiàn)肉眼可見的細小顆粒，即凝集未被抑制，為凝集抑制試驗陰性。待測尿液(含HCG)抗HCG特異結合抗原抗體復合物NS＋致敏膠乳無凝集顆粒為陽性待測尿液(無HCG)抗HCG無結合NS＋致敏膠乳有凝集顆粒為陰性實驗器材和材料器械 黑色方格反應板、毛細滴管試劑與標本膠乳抗原（HCG致敏的膠乳顆粒）、抗HCG抗體（商品化）孕婦尿液、正常人尿液、待測尿液。生理鹽水實驗方法在黑色方格反應板上取3個格，用毛細滴管分別加待測尿液、孕婦尿液、正常人尿液（或生理鹽水）1滴，然后每格加抗HCG抗體1滴，輕輕搖動1～2min。于上述3格中各滴加膠乳抗原1滴，輕輕搖動2～3min后觀察結果。結果判斷如肉眼觀察結果不清楚，可用顯微鏡在低倍鏡下觀察樣本待測尿液孕婦尿液正常人尿(或NS)現(xiàn)象凝集或不凝集不凝集凝集結果判定非妊娠尿或妊娠尿陽性對照陰性對照

注意事項待測尿液宜采用晨尿，不能及時檢測檢測的標本應保存于2~8℃，不能使用嚴重蛋白尿、血尿、菌尿標本；試劑應4℃保存，切勿凍存。使用前使試劑接近室溫并搖勻；應同時設置陽性、陰性對照，以排除非特異性凝集；所加液滴應大小一致；結果應在強光下觀察，觀察時應置黑色背景下或稍傾斜反應板。實驗結果分析和討論妊娠免疫診斷試驗是臨床常用的經(jīng)典膠乳凝集抑制試驗，操作簡便、快速、特異性強，停經(jīng)35～40天以上的孕婦可測得陽性結果。需注意的是，絨毛膜上皮癌、葡萄胎及睪丸畸胎瘤病人尿中HCG含量遠較正常妊娠尿液為高，將尿液作1∶200稀釋后仍可呈陽性反應。待測尿液以晨尿為好。測試時應注意標本及各診斷試劑加入的順序，并設立陽性和陰性對照。試分析若隨意變更加樣順序，如先加標本、再加膠乳抗原，最后加抗HCG或先加膠乳抗原、再加抗HCG，最后加標本，結果如何？

凝集抑制試驗可用于確證呈陽性反應的間接凝集實驗是否是非特異凝集反應，試討論如何進行該項實驗？

不完全抗體檢測的實驗設計（設計性實驗）

實驗目的

采用紅細胞作為凝集試驗的抗原，創(chuàng)造條件設法使相鄰的紅細胞靠近、聚攏、凝集從而達到對紅細胞不完全抗體的檢測目的。問題背景資料

抗體與相應抗原結合后，在適宜的介質參與下可出現(xiàn)可見的抗原抗體反應。但有些分子較小的7S的IgG類抗體，體積小，長度短，在適宜介質中與相應抗原結合后不出現(xiàn)可見反應，這種抗體稱為不