葡萄基因組DNA提取方法的比較

葡萄基因組DNA提取方法的比較園藝專業(yè)指導(dǎo)教師摘要：以葡萄嫩葉為材料提取基因組DNA，為了減少酚類及色素等物質(zhì)的影響，采用經(jīng)過(guò)改良的SDS法和CTAB法對(duì)葡萄葉片進(jìn)行基因組DNA提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA條帶，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在波長(zhǎng)260nm和280nm處的吸光值，并根據(jù)OD/OD的比值分260280析其DNA的純度。試驗(yàn)結(jié)果表明，關(guān)鍵詞：葡萄；DNA提??；CTAB法；SDS法TheComparisonofGrapesGenomicDNAExtraction

MethodStudentmajoringinhorticultureTutorAbstract：Inordertoreducetheinfluenceofphenolicandpigmentandothermaterial,extractDNAfromgrapeleavesformaterial.ExtractgenomicDNAofgrapeswiththemodifiedSDSmethodandCTABmethod,examinetheDNAbandswithagarosegelelectrophoresis,determinetheabsorbancebetweenthewavelengthin260and280nmwithUVspectrophotometer,andanalysisthepurityofDNAaccordingtotheratiooftheOD260/OD280.Keywords:Grapes;ExtractedDNA；CTABMethod;SDSMethod引言生物遺傳信息的載體，是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)。DNA主要集中在細(xì)胞核內(nèi)，線粒體、葉綠體中也含有不少的DNA，在細(xì)胞中它以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。1953年Watson和Crick兩人提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，它的提出拉開了分子生物學(xué)的序幕，為分子遺傳學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。維持DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的力主要有三種：一種是互補(bǔ)堿基之間的氫鍵，它在使四種堿基形成特異性的配對(duì)上是十分重要的，但并不是維持DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定最主要的力，而且氫鍵的斷裂具有協(xié)同效應(yīng)；第二種力是堿基堆積力，是維持DNA穩(wěn)定的主要力量；第三種力是DNA骨架磷酸殘基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽(yáng)離子之間形成的離子鍵。DNA在生理pH條件下帶有大量的負(fù)電荷，要是沒(méi)有陽(yáng)離子（或帶正電的多聚胺、組蛋白等）與它形成離子鍵，DNA鏈由于自身不同部位之間排斥力的作用也是不穩(wěn)定的。原核細(xì)胞的DNA常與精胺、亞精胺結(jié)合，真核生物細(xì)胞的DNA則在核內(nèi)與組蛋白結(jié)合。多糖污染是木本植物DNA提取中最常遇到的問(wèn)題。多糖污染的DNA呈粘稠的膠狀，不但給實(shí)驗(yàn)操作帶來(lái)不便，更重要的是多糖對(duì)反應(yīng)體系中的酶活性產(chǎn)生抑制作用，嚴(yán)重影響分子生物學(xué)研究的下游工作“。很多多年生木本果樹，即使其幼嫩組織多糖的含量也明顯高于大田作物［2］。植物基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)對(duì)所提取的DNA濃度、純度、構(gòu)型、相對(duì)分子質(zhì)量的大小等基本情況進(jìn)行檢測(cè)分析。有時(shí)DNA中含有酚類和多糖類物質(zhì)會(huì)直接影響酶切和PCR的效果。利用DNA分子和蛋白質(zhì)分子分別在紫外光區(qū)波長(zhǎng)260nm和280nm處存在最大吸收峰的特性進(jìn)行分光光度分析，測(cè)定DNA樣品的純度。根據(jù)A260/A28°比值可以估計(jì)DNA樣品的純度，純DNA樣品的A26Q/A280比值為1.8,純RNA樣品的比值為2.0，若DNA樣品的A26°/A280比值大于1.8，說(shuō)明樣品中存在RNA；反之比值小于1.8,說(shuō)明樣品中蛋白質(zhì)雜質(zhì)未除盡⑶。瓊脂糖凝膠電泳是檢測(cè)DNA完整性和分離不同分子量DNA的一種方法。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，是從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取出來(lái)的。由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖結(jié)合的鏈狀多糖。當(dāng)瓊脂糖溶液加熱到沸點(diǎn)后冷卻凝固便會(huì)形成良好的點(diǎn)用介質(zhì)，其密度是由瓊脂糖的濃度決定的。瓊脂糖的特點(diǎn)是不含核酸酶，電泳速度快，經(jīng)EB染色后，熒光背景非常低。凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關(guān)。瓊脂糖凝膠分辨DNA片斷的范圍為0.2?50kb之間；若分辨較小相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段，則要用聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為1bp?1000bp之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越強(qiáng)；反之，濃度越低，孔隙就越大，其分辨能力也就隨之減弱。植物基因組DNA提取方法雖然很多，但每種方法最關(guān)鍵的有3步。第一，破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞膜使DNA釋放到提取緩沖液中；第二，消除蛋白質(zhì)、多糖、色素等雜質(zhì)的污染；第三，防止DNA的降解。各種方法都是針對(duì)以上3步做了不同的改進(jìn)和完善。一般而言，一個(gè)優(yōu)良的DNA提取方法應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①所得到的DNA應(yīng)當(dāng)完整，電泳檢測(cè)時(shí)應(yīng)得到精確性高、重復(fù)性好的遷移帶型；②所得的DNA純度應(yīng)滿足后續(xù)操作的要求；③所得的DNA應(yīng)有足夠的量；④操作程序應(yīng)當(dāng)快速、簡(jiǎn)便、成本低，并盡可能避免使用有毒試劑。1材料和方法試驗(yàn)材料試驗(yàn)材料取自葡萄扦插苗。供試葡萄品種為戶太八號(hào)，是西安市葡萄研究所從歐美雜交品種奧林匹亞芽變中選育的鮮食兼加工的品種。根系發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)和萌芽力強(qiáng)，成花能力強(qiáng)，取樣時(shí)間為2011年4月25日。材料首先用蒸餾水清洗除去表面污物，用紗布或?yàn)V紙吸干表面殘留水分，去掉葉柄，備用。試驗(yàn)方法1.2.1CTAB法（1）試劑DNA緩沖液：2%CTAB（m/v）本實(shí)驗(yàn)采用30g/L70%乙醇，無(wú)水乙醇，ddH2O（滅菌）0.1mol/LTris-HClpH8.0,25mmol/LEDTApH8.0（母液0.5mol/L，乙酸鉀5mol/LpH8.0）1.4mol/LNaCl，2%0-巰基乙醇200mL:另外加入了抗氧化劑：1%抗壞血酸，2％PVP，2％Na2S2O5[4]。0.1mol/LTris-HCl：在800mL水中溶解12.11gTris堿，加入濃HC1調(diào)節(jié)pH值至8.0。2）方法2.0mL離心管加入500yLCTAB提取液（已加入卩-巰基乙醇和PVP）在65°C水浴中預(yù)熱。在液氮中研磨l.Og新鮮或者一20C冷凍的樣品材料，將粉末迅速轉(zhuǎn)移到上述離心管中，65C水浴30min。期間每隔lOmin輕輕搖動(dòng)離心管。加入5mol/L的乙酸鉀充分混勻，在水浴中放置30min，4Cl2000rpm離心5min,吸取上清液。剪掉尖的吸頭（防止吸到沉淀）吸取上清液到1.5mL新離心管中，用氯仿：異戊醇（24:1）重復(fù)抽提一次。12000rpm常溫離心lOmin。用剪掉尖的吸頭（防止吸到沉淀）吸取上清液到1.5mL新離心管中，加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇,輕柔的顛倒混勻，一20C靜置30min,沉淀DNA。12000rpm常溫離心10min,棄上清液，得到DNA沉淀。用500yL冰冷的70%乙醇洗滌沉淀2-3次，每次都是8000rpm常溫離心4min,棄上清，注意防止DNA丟失。用500吐無(wú)水乙醇洗滌沉淀，吹干后用200吐TE溶解DNA。溶解后的DNA再用氯仿：異戊醇（24:1）抽提一遍。12000rpm常溫離心10min。用剪掉尖的吸頭吸取上清液到1.5mL離心管中加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，輕柔的顛倒混勻，一20C靜置30min,沉淀DNA。8000rpm常溫離心，棄上清，70%乙醇洗滌沉淀，再用無(wú)水乙醇洗沉淀,吹干后，用50吐TE（含有RNAase50yL/mL）溶解DNA。37C保溫60min【5-8。1.2.2改良SDS法干燥葉片，用去離子水洗凈，在液氮中研磨10min,分裝3管。加人800吐的SDS提取液（臨用前加入2吐卩-巰基乙醇，20%的PVP100吐），輕輕振動(dòng)，65C條件下水浴30min；加入90吐15mol/L的KAc。一20°C條件下冰浴30min；4°C、10000rpm離心15min；取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇（24：1）,輕輕振動(dòng)；4C,10000rpm離心15min；取上清液，加入等體積異丙醇，輕輕振動(dòng)幾下，室溫靜置30min,12000rpm離心10min,取沉淀加入預(yù)冷的75%乙醇洗滌干燥；沉淀用500yLTE溶解，靜置5min,加入等體積氯仿/異戊醇(24：1)。輕輕振動(dòng)幾下，靜置10min；4°C12OOOrpm離心10min：取上清液，加入lyLRNAase輕輕振動(dòng)，混勻，37C條件下保溫1h,加入600yL氯仿/異戊醇(24：1)，輕輕振動(dòng)；4C，12OOOrpm離心10min；取上清液，加入2.5mol/L的醋酸銨60yL，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，室溫靜置30min，12000rpm離心10min；去除上清，沉淀干燥后，用30mLTE在37C水浴溶解DNA,RNAase消化RNA[9]。DNA質(zhì)量檢測(cè)1.3.1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)制作1%的瓊脂糖凝膠：稱取0.15g瓊脂糖，用500倍的TAE18m1微波爐加熱溶解，滴入2ulEB，做成膠，放置30min。吸取提取的DNA溶液5吐，電泳檢測(cè)。用九DNA做分子量大小的Marker，如果帶型不彌散，在與Marker20kb的帶相應(yīng)位置出現(xiàn)整齊明亮的條帶，說(shuō)明基因組DNA完整，沒(méi)有降解。1.3.2提取的DNA的濃度檢測(cè)取少量待測(cè)DNA樣品，用TE或者蒸餾水稀釋50倍。用TE或者蒸餾水做空白，在260nm、280nm、310nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)至零。加入待測(cè)DNA樣品在三個(gè)波長(zhǎng)處讀取OD值。純DNA樣品的0。260/0。280大約為1.8，高于1.8可能有RNA污染，低于1.8有蛋白質(zhì)污染DNA濃度計(jì)算雙鏈DNA(dsDNA)：[dsDNA]=50x(OD260-OD310)x稀釋倍數(shù)RAPD-PCR擴(kuò)增試驗(yàn)采用10》1反應(yīng)體系，其中含10mmo1/LTris-HCl(pH=8.3)，50mmo1/LKC1，2.5mmo1/LMgC12，0.01mg/m1明膠，0.2mmo1/LdNTPs，5pg牛血清蛋白，1.5UTaqDNA聚合酶，2~5ng模板DNA，0.2》mol/L引物P](5'TGCCGCCAAG3')。擴(kuò)增程序：94C預(yù)變性4min；94C變性30s,30?40C退火40s,72C延伸1min，40個(gè)循環(huán)；72C延伸10min；4°C保存。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，每管取5》1擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，約1h。電泳結(jié)束后，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照。2結(jié)果與分析2.1DNA電泳檢測(cè)分析葡萄基因組DNA提取液電泳結(jié)果如圖1所示，1?3為改良SDS法提取的DNA,4?6為CTAB法提取的DNA，根據(jù)條帶亮度和RNA消化情況，可以看出SDS法和CTAB法均有拖尾現(xiàn)象發(fā)生；在點(diǎn)樣量相等的條件下，CTAB法提取的DNA中RNA消化不完全，但是從亮度看，所提取的DNA峰值較高。從而說(shuō)明CTAB法較改良SDS法提取的葡萄基因組DNA產(chǎn)率較高。在實(shí)驗(yàn)中，可以通過(guò)調(diào)節(jié)體系中RNase終濃度消除RNA對(duì)本底的影響，圖1。I注：I注：M為分匚2.2比色參數(shù)測(cè)e法提取DNA由表1可知不同方法所提取的DNA在純度及濃度有所差異。根據(jù)260nm、280nm、310nm的吸光值，按公式計(jì)算各處理OD260/OD280和DNA產(chǎn)量，試驗(yàn)260280結(jié)果如表1所示。改良SDS法提取葡萄基因組DNAOD260/0D簡(jiǎn)1.7?1.8之間,260280說(shuō)明樣品中存在較多蛋白，應(yīng)該進(jìn)一步抽提或者調(diào)解氯仿和異戊醇比例，以消除蛋白質(zhì)的影響。CTAB法提取的DNA白色絮狀沉淀，溶解后溶液清亮，無(wú)粘稠感，濃度也較高，OD260/OD280在1.9?2.0之間，說(shuō)明該方法提取的DNA樣品中基本無(wú)多糖和酚類等雜質(zhì)的污染，純度較好，但是RNA未消化徹底，在實(shí)驗(yàn)中需要增加RNase。比較兩種提取方法對(duì)葡萄基因組DNA產(chǎn)量的影響，改良SDS法提取DNA平均產(chǎn)量為1362.5ng/pl，CTAB法為1596.67ng/pl。表1不同葡萄基因組DNA提取結(jié)果比較Table1ComparisonoftheresultofdifferentgrapegenomicDNAextraction處理叫60叫80叫10OD260/OD280產(chǎn)量ng/“l(fā)改良10.5980.3390.0561.7641355SDS20.6240.3550.0481.758144030.5560.3120.0391.782129240.6360.3340.0621.9041435CTAB50.6850.3480.0671.968154560.7930.3970.0691.9971810圖2不同方法提取模板DNA對(duì)RAPD反應(yīng)的影響Fig.2EffectsoftemplateDNAofdifferentgrapegenomicDNAextractiononRAPDreaction注：1?3改良SDS法；4?6為CTAB法RAPD-PCR擴(kuò)增通過(guò)RAPD-PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，改良SDS法和CTAB法提取葡萄基因組DNA完全可以作為模板，隨即擴(kuò)增均具有特征條帶（圖2）。電泳結(jié)果表明，兩種方法條帶亮度不同。1?3為改良SDS法提取DNA作為模板，4~6為CTAB法提取DNA為模板，前者擴(kuò)增條帶暗淡，說(shuō)明RAPD-PCR擴(kuò)增結(jié)果受模板DNA濃度影響較大。對(duì)于RAPD反應(yīng)，穩(wěn)定可重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果受體系中Mg2+農(nóng)度、TaqDNA聚合酶活力、dNTPS濃度和退火溫度的影響。除此之外，模板DNA濃度和純度也是一個(gè)不可忽視的重要因素。如樣品中蛋白質(zhì)、多糖及酚類物質(zhì)較多，擴(kuò)增條帶就比較微弱，本試驗(yàn)充分說(shuō)明了這一點(diǎn)。本試驗(yàn)結(jié)果表明兩種方法提取的葡萄基因組DNA可滿足RAPD-PCR擴(kuò)增要求，但仍需要進(jìn)一步優(yōu)化［⑹。3討論目前，關(guān)于植物總DNA的提取方法已報(bào)道了許多，各種方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)。CTAB是種去荷劑，它既可以裂解細(xì)胞，又可與DNA形成復(fù)合物而溶于高鹽溶液中，當(dāng)鹽濃度降低時(shí)此復(fù)合物將析出，同時(shí)CTAB法有效地沉淀多糖。對(duì)酚類化合物的去除效果不是很理想，實(shí)驗(yàn)步驟也比較繁瑣。實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)具體的要求選擇適當(dāng)?shù)奶崛》椒ǎ?1］。SDS也是去污劑，可直接裂解細(xì)胞，使其釋放出棱DNA，經(jīng)過(guò)一些步驟的改進(jìn)，結(jié)果顯示DNA的質(zhì)量很好。但是，其產(chǎn)量很低，且不能有效去除蛋白質(zhì)污染，DNA降解嚴(yán)重。而CTAB法產(chǎn)物的蛋白質(zhì)雜質(zhì)較少，DNA降解程度輕，且產(chǎn)率較高。充分滿足了分子檢測(cè)的要求。CTAB能與核酸形成特異的可溶性復(fù)合物，對(duì)DNA的選擇溶解性強(qiáng)。在抽提過(guò)程中加入CTAB，可使蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的萃取更為徹底，原因可能是因?yàn)榧尤隒TAB，調(diào)節(jié)至高離子強(qiáng)度的溶液時(shí)，酚和氯仿連續(xù)抽提后可去除CTAB、黏多糖和蛋白質(zhì)復(fù)合物等雜質(zhì)，使提取的DNA純度提高［12,13］。兩種方法所提取的葡萄基因組DNA均可用于PCR操作?所得RAPD條帶清晰，重復(fù)性好。其中改良SDS法的DNA濃度較低，但擴(kuò)增后產(chǎn)物濃度卻很高，說(shuō)明所得DNA的質(zhì)量較高，相反CTAB的質(zhì)量就較低。總之，擴(kuò)增后的分析結(jié)果與上述結(jié)果基本保持一致?？傊?，CTAB法效果較好，當(dāng)然實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)具體的要求選擇適當(dāng)?shù)奶崛》椒?。為了更有效地去除雜質(zhì)，提高DNA的質(zhì)量，采取了以下措施：①在適當(dāng)步驟中加大了離心力和離心時(shí)間；②所有方法中均避免了酚的使用，采用氯仿一異戊醇抽提，克服酚對(duì)人體的危害及酚的殘留對(duì)下一步分子操作帶來(lái)的困難；③PVP（聚乙烯吡咯烷酮）酚類結(jié)合試劑，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易除去。2種方法中均加入了一定量的PVP，其中改良SDS法是在研磨過(guò)程中添加適量PVP，0-巰基乙醇具有阻止酚類物質(zhì)氧化的作用，可有效地防止褐變，二者的聯(lián)合使用在去除葡萄酚類化合物方面取得了良好效果。致謝首先感謝的是我的導(dǎo)師劉更森老師，論文工作是在劉老師的悉心知道下完成的，從論文的選題到最終完成，劉老師都傾注了大量的時(shí)間和精力，及時(shí)指導(dǎo)我解決所遇到的難題。畢業(yè)在即，謹(jǐn)向尊敬的劉老師致以最真摯的感謝和最久遠(yuǎn)的祝福。此外，我還要感謝的是與學(xué)院的所有老師們，是他們給我提供了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲协h(huán)境。在此，衷心地祝愿他們工作順利，身體健康。最后感謝在這四年中所有給過(guò)我?guī)椭椭С诌^(guò)我的人，衷心感謝他們?yōu)槲宜鞯囊磺?。參考文獻(xiàn)：程運(yùn)江，伊華林，龐曉明,郭文武，鄧秀新.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001,20(5):481?483李春霞，李宏飛.CTAB法高效提取蘋果葉片DNA的研究?北方園藝,2009,(