附子和附片的質(zhì)量控制

附子和附片的質(zhì)量控制

附子為2005年中國(guó)藥典的一個(gè)品種，包括鹽附子、黑順片和白附片。原標(biāo)準(zhǔn)采用分光光度法鑒別生物堿類(lèi)成分,專(zhuān)屬性較差,且不能區(qū)分毒性強(qiáng)的雙酯型成分和毒性較弱的單酯型成分。采用薄層色譜法對(duì)烏頭堿進(jìn)行限量檢查,方法較為粗放,難以有效控制質(zhì)量。近年來(lái),有關(guān)附子的研究屢見(jiàn)不鮮,但根據(jù)樣品用途和生物堿類(lèi)別同時(shí)對(duì)附子的安全性和有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次根據(jù)樣品不同情況,采用相應(yīng)的指標(biāo)測(cè)定附子和附片,可更全面地控制藥材的質(zhì)量,為《中國(guó)藥典》2010年版附子和附片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。附子所含的雙酯型生物堿毒性很強(qiáng),經(jīng)炮制加工,此類(lèi)成分可轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿,毒性也隨之減小。鹽附子為炮制品淡附片的原料,不直接入藥,且未經(jīng)高溫蒸煮加工,故以雙酯型生物堿作為質(zhì)量控制指標(biāo)。另一方面,為防止炮制太過(guò),導(dǎo)致雙酯型生物堿較多轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿,故又建立了鹽附子中單酯型生物堿限量檢查方法。相反,黑順片、白附片均經(jīng)高溫蒸煮加工而成,故以單酯型生物堿作為質(zhì)量控制指標(biāo)。另一方面,因兩者均直接入藥,需控制雙酯型生物堿限量。本實(shí)驗(yàn)將鹽附子與黑順片、白附片分列,分別研究附子與附片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。建立了以新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿等雙酯型生物堿和苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿等單酯型生物堿為指標(biāo)的薄層鑒別方法,專(zhuān)屬性強(qiáng),色譜分離良好。建立的高效液相色譜法,可同時(shí)測(cè)定6種生物堿的含量,繼而根據(jù)不同樣品選擇相應(yīng)指標(biāo)對(duì)附子和附片進(jìn)行質(zhì)量控制。1omat-5成分島津LC-2010液相色譜儀(配備單波長(zhǎng)檢測(cè)器),MettlerAE240電子天平,ANDFX-200電子天平,高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司),FED-115烘箱,CAMAGLinomat-5半自動(dòng)點(diǎn)樣臺(tái),CAMAGREPORTSTAR薄層色譜攝像系統(tǒng)。硅膠G薄層板(青島海洋化工廠和煙臺(tái)化學(xué)試劑公司),乙腈、四氫呋喃為色譜純,異丙醇、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、冰醋酸、醋酸銨、氨水、正己烷、甲醇為分析純,超純水為RO-ZY-30型純水機(jī)和Milli-Q純水系統(tǒng)二次制備。黑順片10批、白附片8批、鹽附子8批(四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司)。新烏頭堿(110799-200404)、次烏頭堿(110798-200404)、烏頭堿(110720-200410)對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所),苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿為自行制備,經(jīng)標(biāo)化純度大于98%。2關(guān)于下層鑒定方法的研究2.1烷-乙酸乙酯-甲醇法固定相:硅膠G薄層板;展開(kāi)劑:正己烷-乙酸乙酯-甲醇(6.4∶3.6∶1),氨蒸氣飽和20min;顯色劑:稀碘化鉍鉀試液,日光下檢視。2.2對(duì)照品溶液的制備取新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對(duì)照品(用于附子的鑒別)或苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品(用于附片的鑒別)適量,加異丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液制成每1mL各含1mg的混合溶液,作為對(duì)照品溶液。2.3供試品溶液的制備取本品粉末2g,加氨試液3mL潤(rùn)濕,加入乙醚25mL,25℃以下超聲處理30min,濾過(guò),取濾液低溫回收溶劑至干,殘?jiān)佣燃淄?.5mL使溶解,作為供試品溶液。2.4薄層板下色譜點(diǎn)樣的測(cè)定取鹽附子、黑順片、白附片供試品溶液各一份,分別采用青島海洋化工廠和煙臺(tái)化學(xué)試劑公司生產(chǎn)的硅膠G薄層板點(diǎn)樣檢測(cè),結(jié)果顯示,各供試品溶液在兩個(gè)廠家的薄層板上色譜行為基本一致。見(jiàn)圖1,2(青島海洋化工廠)。2.5不同樣品原則依法對(duì)樣品進(jìn)行鑒別,結(jié)果見(jiàn)圖3~5(煙臺(tái)化學(xué)試劑公司)。鹽附子樣品均可檢出與新烏頭堿、烏頭堿或次烏頭堿對(duì)照品相應(yīng)的斑點(diǎn);黑順片和白附片樣品均可檢出與苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿或苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品相應(yīng)的斑點(diǎn),但因不同樣品生物堿含量變化較大,各斑點(diǎn)顏色深淺明顯不同,有的斑點(diǎn)未檢出。規(guī)定檢出3個(gè)指標(biāo)中的一個(gè)即認(rèn)為合格。3有限檢測(cè)方法的研究3.1流動(dòng)相及洗脫溫度色譜柱:PhenomexGeminiC18柱(4.6mm×250mm,5μm),柱溫:35℃;流動(dòng)相:以乙腈-四氫呋喃(25∶15)為流動(dòng)相A,以0.1mol·L-1醋酸銨為流動(dòng)相B,按下列程序進(jìn)行梯度洗脫:0min,15%A;48min,26%A;48.1min,35%A;58min,35%A,流速0.8mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):235nm。3.2對(duì)照品溶液的制備分別精密稱(chēng)取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品(用于附子的限量檢查)或新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿對(duì)照品適量,加異丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液制成每1mL分別含5μg的混合溶液,作為對(duì)照品溶液。3.3超聲處理法取本品適量,粉碎,過(guò)三號(hào)篩,精密稱(chēng)取粉末約2g置具塞錐形瓶中,精密加入氨試液3mL,再精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50mL,稱(chēng)重,25℃以下超聲處理30min,放至室溫,再稱(chēng)重,補(bǔ)足減失重量,濾過(guò),精密量取續(xù)濾液25mL,40℃以下回收溶劑至干,精密加入異丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液3mL溶解殘?jiān)?溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò),即得。3.4外標(biāo)法計(jì)算含量精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各10μL,注入液相色譜儀,測(cè)定,外標(biāo)法計(jì)算含量。單酯型烏頭堿含量以苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿含量之和計(jì),雙酯型烏頭堿含量以新烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿含量之和計(jì)。3.5相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差取對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,各色譜峰保留時(shí)間及峰面積值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%,理論板數(shù)在26941~44642之間,分離度在2.6~16.8之間。對(duì)照品溶液及鹽附子、黑順片和白附片供試品溶液色譜圖見(jiàn)圖6。3.6混合對(duì)照品溶液精密稱(chēng)取對(duì)照品各5mg于50mL量瓶中,加異丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液溶解并稀釋至刻度,即得質(zhì)量濃度為100μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。精密量取上述溶液適量,逐級(jí)稀釋制得質(zhì)量濃度分別為50、20、10、5μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液,取上述5個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,以濃度為橫坐標(biāo)x,峰面積為縱坐標(biāo)y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),并進(jìn)行線(xiàn)性回歸,在5~100μg·mL-1內(nèi),6種烏頭堿線(xiàn)性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均為0.9999,見(jiàn)表1。3.7檢出限和測(cè)定下限精密量取質(zhì)量濃度為10μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液適量,稀釋至不同濃度,進(jìn)樣測(cè)定,6種烏頭堿的檢出限(信噪比3∶1)和定量限(信噪比10∶1)分別為1和3μg·mL-1;方法檢出限和定量限分別為0.0003%和0.001%。4重量法的研究4.1對(duì)照品溶液的制備分別精密稱(chēng)取新烏頭堿、次烏頭堿、烏頭堿(用于附子的含量測(cè)定)或苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿(用于附片的含量測(cè)定)對(duì)照品,加異丙醇-二氯甲烷(1∶1)混合溶液制成每1mL分別含10μg的混合溶液,作為對(duì)照品溶液。4.2精密度實(shí)驗(yàn)取鹽附子、黑順片和白附片的供試品溶液各一份,分別連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果各峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%。4.3重復(fù)實(shí)驗(yàn)取鹽附子、黑順片和白附片樣品,分別平行制備6份供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算6種烏頭堿類(lèi)生物堿含量,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%。4.4穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)取鹽附子、黑順片和白附片的供試品溶液各一份,分別于0,1,3,6,12h進(jìn)樣測(cè)定,各峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%。4.5化學(xué)加樣回收試驗(yàn)精密量取混合對(duì)照品溶液適量于錐形瓶中,40℃下減壓回收溶劑至干,放冷,精密稱(chēng)取已知含量的鹽附子、黑順片和白附片樣品1g,按供試品溶液制備方法分別平行制備6份加樣回收溶液,進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算各化學(xué)成分回收率,6種成分平均回收率均在95%~105%之間。4.6色譜柱的測(cè)定取同一份供試品溶液,分別采用LinchrospherC18柱(4.6mm×250mm,4μm)和ZobaxEclipseXDB-C18柱(4.6mm×250mm,5μm)測(cè)定含量,與PhenomenexGeminiC18柱(4.6mm×250mm,4μm)測(cè)得的含量進(jìn)行比較,3種色譜柱測(cè)得各成分含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%。4.7有限檢測(cè)和含量測(cè)定依法測(cè)定了8份鹽附子中單/雙酯型生物堿及10份黑順片和8份白附片中雙/單酯型生物堿含量,平行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表2。5附片與金屬離子檢測(cè)5.1建立的薄層鑒別方法對(duì)溫濕度要求較高,應(yīng)在低溫干燥環(huán)境下操作。薄層板和展開(kāi)缸應(yīng)預(yù)飽和至少20min。5.28批附子樣品單酯型生物堿含量除一批特別高(0.016%)外,其余均在0.005%以下,最高值為0.004%,故建議將附子單酯型生物堿限量檢查限度定為0.005%。18批附片樣品雙酯型烏頭堿含量在0~0.017%之間,建議限度為0.020%。8批附子樣品雙酯型生物堿含量除一批特別高(0.655%)外,其余均在0.010%~0.100%內(nèi),含量在0.010%以上(含0.010%)的有8批,占100%。另一方面,因附子不直接入藥,其含量測(cè)定意義在于控制雙酯型生物堿含量,為進(jìn)一步加工炮制提供可靠的原料,故建議附子的雙酯型生物堿含量不得低于0.010%。18批附片樣品中單酯型生物堿含量在0.001%~0.071%