海帶渣固體發(fā)酵產(chǎn)植物激素6-糠氨基嘌呤的研究

海帶渣固體發(fā)酵產(chǎn)植物激素6-糠氨基嘌呤的研究

傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)主要依靠化學農(nóng)藥和化學肥料的使用。為了在高產(chǎn)生產(chǎn)中取得成功，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者經(jīng)常使用化學農(nóng)藥和化學肥料，導致化肥和土壤肥力不足、土壤養(yǎng)分失衡、土壤侵蝕、土壤侵蝕、，河流和地下水污染等問題。為了自身改善，減少了對外部不利條件的抵抗力，并影響了我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。與此同時隨著人們對食物品質(zhì)要求的提高,以及對有害生物綜合治理與有害生物生態(tài)治理認識的加強,現(xiàn)在科研工作者越來越多的把目光投到植物與微生物之間的作用,以及植物與其所在生態(tài)環(huán)境中的各個因子之間的相互作用上,因此分離篩選具有多種PGPR特性的微生物肥料菌株,成為廣大微生物科研工作者的研究重點。微生物肥料的應用也已被證明是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑,是生產(chǎn)綠色食品的重要內(nèi)容.目前微生物肥料在多種作物上得到廣泛應用,并取得了良好的經(jīng)濟效益、社會效益與生態(tài)效益。海帶是一種在低溫海水中生長的大型海生褐藻植物,它含有許多陸生植物不具有的碘、鉀、鎂、錳和鈦等微量元素以及海藻多糖、甘露醇等。有研究證明,海帶中含有大量的高活性成分和天然植物生長調(diào)節(jié)劑,可刺激植物體內(nèi)非特異性活性因子的產(chǎn)生,能促進作物生長發(fā)育,提高產(chǎn)量。目前我國的海帶加工主要是提取碘,這個過程同時會產(chǎn)生大量的廢棄物海帶渣。海帶渣中的主要成分為海藻纖維、蛋白質(zhì)、海藻多糖、殼聚糖、多酚和甜菜堿等,現(xiàn)階段除了部分作為飼料使用,大多都當作工業(yè)垃圾處理了。利用海帶渣生產(chǎn)有機肥,生產(chǎn)有機燃料,等,不僅可以減少對環(huán)境的污染,還能充分利用其中多種未被利用的營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分,有效地變廢為寶。響應面分析法是20世紀中后頁發(fā)展起來的優(yōu)化實驗條件的統(tǒng)計學方法,能用較少的實驗數(shù)據(jù)推算出目標值的優(yōu)化條件,優(yōu)化效果好,在微生物發(fā)酵方面已經(jīng)得到了廣泛的應用。本研究旨在通過對一株具有潛在應用價值的枯草芽孢桿菌菌株進行海帶渣的固體發(fā)酵,研究其以海帶渣為基本培養(yǎng)基進行固體發(fā)酵的特性,通過單一因素實驗和響應面實驗進行產(chǎn)抑制寄生曲霉活性物質(zhì)的發(fā)酵條件優(yōu)化。1材料和方法1.1曲霉突變菌株的分離培養(yǎng)實驗室分離得到的具有應用潛力的生防枯草芽孢桿菌JGA2(-5)27-2;能積累紅色黃曲霉毒素中間產(chǎn)物的NA突變寄生曲霉突變菌株;GY固體培養(yǎng)基:20g/L葡萄糖,5g/L酵母粉,20g/L瓊脂;GY液體培養(yǎng)基:20g/L葡萄糖,5g/L酵母粉。海帶渣、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、酵母粉、牛肉膏、NaNO3和(NH4)2SO4、NH4NO3等。1.2高效液相色譜法檢測高效活性接種母液:將試管斜面上的生防枯草芽孢桿菌JGA2(-5)27-2取一環(huán)接種到裝有20mLGY培養(yǎng)液的三角瓶中進行35℃,150r/min,條件下的搖床培養(yǎng),培養(yǎng)12h。海帶渣的固體發(fā)酵:對海帶渣進行粉碎(0.5mm);采用培養(yǎng)瓶進行海帶渣的固體發(fā)酵,每個培養(yǎng)瓶中裝40g干海帶渣與60mL的去離子水,pH值為自然,滅菌。按照4%的接種量(4mL)將接種母液接種到滅菌后的固體培養(yǎng)基中進行固體發(fā)酵。發(fā)酵溫度為35℃,發(fā)酵時間為9d。發(fā)酵產(chǎn)物pH值的測定:取5g發(fā)酵產(chǎn)物到裝有50mL蒸餾水的三角瓶中,充分振蕩2到3min,靜置1min后用pH計對液體的pH值進行測定。海帶渣固體發(fā)酵產(chǎn)物水提取液:取5g發(fā)酵產(chǎn)物到裝有45mL蒸餾水的三角瓶中,振蕩30min,10000r/min轉(zhuǎn)離心15min,取上清,用0.22μm微孔濾膜過濾,過濾液備用。96孔板檢測對寄生曲霉的抑制活性:實驗采用96孔板微培養(yǎng)來對發(fā)酵產(chǎn)物水提取液的抑制寄生曲霉的活性進行檢測。先在96孔板的每個孔中加60μLGY固體培養(yǎng)基,然后將各處理的提取液(或者稀釋后的提取液)按照60μL的量添加到孔中,每個處理3個重復,每個孔中接種5μL寄生曲霉孢子。將96孔板放置培養(yǎng)箱中進行28℃條件下的保濕培養(yǎng),培養(yǎng)4~6d后觀察每個孔中寄生曲霉的生長與產(chǎn)紅情況。對96孔板分析不能得到較好結(jié)果的需要進一步的采用Tip-culture法進行定量分析。植物激素細胞分裂素的測定:利用高效毛細管電泳法對發(fā)酵產(chǎn)物水提取中的植物激素細胞分裂素進行檢測。電泳操作條件如下:未涂層石英毛細管(50μm×57cm,有效檢測長度48cm);運行緩沖液20mmol/L硼砂緩沖液(pH9.0);20mmol/L磷酸二氫鈉溶液;檢測波長200nm;分離電壓20kV;溫度28℃;重力進樣20s(高度10cm)。毛細管柱使用前用0.1mol/L的NaOH、水、電泳緩沖液分別沖洗1、2和3min。樣品溶液的配制:將處理好的代謝物粗品用適量的甲醇溶解,并用0.22μm孔徑的有機濾膜濾過,棄去初濾液,收集續(xù)濾液作為樣品溶液碳源的優(yōu)化:海帶渣為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,含水量為60%。以海帶渣為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,并分別添加2%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉為外加碳源,以不添加任何碳源的海帶渣基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照。培養(yǎng)基滅菌后按照4%的接種量進行接種,35℃條件下分別培養(yǎng)3、6、9、12和15d后,取樣檢測活性。氮源的優(yōu)化:在海帶渣基礎(chǔ)培養(yǎng)中分別添加酵母粉(20g/kg)、牛肉膏(20g/kg)、NaNO3(6g/kg)、(NH4)2SO4(6g/kg)、NH4NO3(6g/kg)為外加氮源,以不添加任何氮源的海帶渣基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照。培養(yǎng)基滅菌后按照4%的接種量進行接種,35℃條件下分別培養(yǎng)3、6、9、12和15d后,取樣檢測活性。培養(yǎng)時間的優(yōu)化:以海帶渣為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,并在其中添加2%的蔗糖為外加碳源,培養(yǎng)基滅菌后按照4%的接種量進行接種,35℃條件下分別培養(yǎng)3、6、9、12、15和24d后,取樣檢測活性。含水量的優(yōu)化:以海帶渣為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,含水量分別為50%、55%、60%、65%和70%,并在其中添加2%的蔗糖為外加碳源,培養(yǎng)基滅菌后按照4%的接種量進行接種,35℃條件下分別培養(yǎng)9d后,取樣檢測活性。培養(yǎng)溫度的優(yōu)化:分別在31、33、35、37和39℃條件下進行發(fā)酵,并對樣本進行檢測。接種量的優(yōu)化:分別按照2%、4%、6%、8%、10%和12%的接種量進行接種,發(fā)酵后對所取的發(fā)酵產(chǎn)物進行檢測活性。pH值的優(yōu)化:分別用pH值為1.0、2.0、6.5、7.0、7.5和8.0的去離子水進行海帶渣發(fā)酵固體培養(yǎng)基的配制,發(fā)酵后對所取的發(fā)酵產(chǎn)物進行檢測活性。根據(jù)單因素實驗結(jié)果,確定海帶渣發(fā)酵過程中的關(guān)鍵性因素,并通過爬坡實驗和響應面分析法進一步的對海帶渣固體發(fā)酵的條件進行優(yōu)化。2培養(yǎng)基活性的檢測碳氮的優(yōu)化:96孔板檢測在外加不同碳源條件、不同發(fā)酵時間下海帶渣固體發(fā)酵后產(chǎn)物水提取液的抑制寄生曲霉的活性(如圖1)。每個孔中用移液槍加60μL2GY固體培養(yǎng)基,然后分別添加60μL不同碳源和不同培養(yǎng)時間下的海帶渣固體發(fā)酵后的水提取液。CK-1、1-1、2-1、3-1、4-1和5-1分別為對照組、葡萄糖組、蔗糖組、麥芽糖組、乳糖組和淀粉組發(fā)酵3d后的所取樣本的活性。X-2、X-3、X-4和X-5分別表示該組發(fā)酵6、9、12和15d后所取的樣本的活性。實驗結(jié)果表明,外加碳源能較好地提高海帶渣固體發(fā)酵產(chǎn)物的活性,CK的所有檢測中均產(chǎn)紅,表明不加任何外加碳源的條件下海帶渣固體發(fā)酵不能產(chǎn)生有效的抑制活性物質(zhì);在外加蔗糖的海帶渣固體發(fā)酵條件下所產(chǎn)生的活性物質(zhì)活性最強,蔗糖組的所以檢測孔中均未產(chǎn)紅。利用毛細管電泳法對常見的激素(植物生長素、細胞分裂素、脫落酸和赤霉素。植物激素細胞分裂素)進行檢測,只有在外加蔗糖組中檢測到了細胞分裂素6-糠氨基嘌呤的產(chǎn)生。氮源的優(yōu)化:96孔板檢測在外加不同氮源條件、不同發(fā)酵時間下海帶渣固體發(fā)酵后產(chǎn)物水提取液的抑制寄生曲霉的活性。因96孔的檢測結(jié)果不能明顯的區(qū)別去最優(yōu)的氮源,進一步用Tip-culture的檢測法進行定量的分析。采用Tip-culture(400μL2GY+400μL海帶渣發(fā)酵水提取液+5μL寄生曲霉孢子懸液)的定量的檢測方法對發(fā)酵9d后的培養(yǎng)基的活性進行檢測結(jié)果如圖2所示。從左到右分別為GY組、CK組(未加外加碳源)、酵母粉組、蛋白胨組、NaNO3組、(NH4)2SO4組和NH4NO3組。各組中寄生曲霉的生長量為:0.0602、0.0400、0.0207、0.0136、0、0.0160和0g。利用毛細管電泳法對常見的激素進行檢測,各個樣本均未檢測出植物生長素、細胞分裂素、脫落酸和赤霉素。發(fā)酵時間的優(yōu)化:以外加2%蔗糖的海帶渣固體培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng),利用96孔板微培養(yǎng)進行活性的檢測。96孔板微培養(yǎng)的結(jié)果表明:海帶渣固體發(fā)酵9d后的樣本的活性最佳。培養(yǎng)3、6、9、12、15和24d后海帶渣固體發(fā)酵產(chǎn)物的pH值分別為7.66、8.07、8.20、8.25、8.25和8.30。含水量的優(yōu)化:當含水量高于65%時,海帶渣的固體明顯的減小;96孔板對活性進行檢測時,發(fā)現(xiàn):50%與55%的含水量時海帶渣的固體發(fā)酵產(chǎn)物的活性低,多數(shù)檢測孔產(chǎn)紅;60%、65%和70%的含水量時海帶渣固體發(fā)酵產(chǎn)物的活性較高,檢測孔基本不產(chǎn)紅。發(fā)酵9d后各自的pH值分別為8.04、8.07、8.15、8.08和7.82。發(fā)酵溫度的優(yōu)化:96孔板微培養(yǎng)對不同溫度條件下發(fā)酵9d后的海帶渣的活性進行檢測,實驗結(jié)果表明:35℃下發(fā)酵的海帶渣的活性高于其他溫度條件下發(fā)酵的海帶渣產(chǎn)物活性。接種量的優(yōu)化:實驗采用Tip-culture法(400μL2GY+400μL海帶渣發(fā)酵水提取液+5μL寄生曲霉孢子懸液)對不同接種量條件下發(fā)酵9d后的海帶渣的活性進行定量檢測。實驗結(jié)果表明,2%接種量的抑制寄生曲霉生長率為69.3%,4%接種量的抑制寄生曲霉生長率為83.5%,6%接種量的抑制寄生曲霉生長率為40.2%,8%接種量的抑制寄生曲霉生長率為59.5%,10%接種量的抑制寄生曲霉生長率為73.4%,12%接種量的抑制寄生曲霉生長率為62.7%。除CK組中的Tip管外,其他的Tip管均不產(chǎn)紅。實驗表明,4%的接種量為最優(yōu)的接種量。pH值的優(yōu)化:海帶渣中含有大量的堿性金屬離子,分別用pH值為1.0、2.0、6.5、7.0、7.5和8.0的去離子水配制海帶渣發(fā)酵固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基滅菌后的pH值都在7.5~7.7之間,所以確定海帶渣固體發(fā)酵的初始pH值為自然(7.6左右)。從上面的單因素優(yōu)化實驗的結(jié)果看蔗糖是海帶渣固體發(fā)酵產(chǎn)物活性大小的決定因素,只有在外加蔗糖時,海帶渣固體發(fā)酵才能更有效地產(chǎn)生抑制寄生曲霉的活性物質(zhì),也只有在外加蔗糖時,海帶渣固體發(fā)酵才能有效地產(chǎn)生類植物激素細胞分裂素6-KT。鑒于K肥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要意義,實驗以KNO3的形式將K+離子與NO3-離子引入到海帶渣固體培養(yǎng)基中,并進一步研究了以蔗糖和KNO3為外加碳源和氮源在不同水平上對海帶渣固體發(fā)酵產(chǎn)物抑制寄生曲霉活性的影響。通過爬坡實驗和響應面分析法進一步的對海帶渣固體發(fā)酵的條件進行優(yōu)化。爬坡實驗:爬坡實驗設(shè)計如表1所示,發(fā)酵5、10、15和55d后分別取樣,采用Tip-culture的培養(yǎng)法(400μL2GY+200μL無菌水+200μL海帶渣發(fā)酵水提取液+5μL寄生曲霉孢子懸液)對抑制寄生曲霉的活性進行定量的測定,測定的結(jié)果如表2所示。從實驗的結(jié)果可知,第3組的活性最強,所有組合中活性最強的培養(yǎng)時間為5d或者10d,因此,以第3組和發(fā)酵8d作為響應面實驗的中心點,即:蔗糖2.00%,KNO30.50%,培養(yǎng)時間8d。RSM優(yōu)化培養(yǎng)基組成:根據(jù)單因素實驗和爬坡實驗的結(jié)果對實驗進行響應面設(shè)計,實驗采用BoxBenhnken實驗設(shè)計海帶渣固體發(fā)酵的條件,實驗采用3因素3水平的響應面分析。Box-Benhnken設(shè)計每個因素取3個水平,以(-1,0,+1)編碼,對數(shù)據(jù)進行二次回歸,擬合,得到包括一次項、平方項和交互項的二次方程,分析各因素的主效應和交互效應,最后在一定水平范圍內(nèi)求取最佳值。本實驗以對寄生曲霉的生長的抑制率為響應變量,并以蔗糖(%)、KNO3(%)及培養(yǎng)時間(d)為影響因子進行Box-Behnken響應面分析。實驗方案及結(jié)果如表3所示,回歸分析結(jié)果如表4所示。多項式模型方程擬合的性質(zhì)由確定系數(shù)R2表達,其統(tǒng)計學上的顯著性由T檢驗確定。方程模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.8873,表明方程模型于實驗數(shù)據(jù)有88.73%的符合度,調(diào)整后的R2Adj=0.7425,表明方程模型有較高的可信度。每個響應面分別代表著2個獨立變量之間的相互作用,此時第3個變量保持在編碼的0水平。由響應面圖(圖3)可以看出,蔗糖濃度、KNO3濃度和培養(yǎng)時間與對寄生曲霉生長的抑制率存在相關(guān)性,培養(yǎng)基中的隨著蔗糖濃度、KNO3濃度與培養(yǎng)時間的增加,抑制率先增加后降低。在獲得非線性回歸模型和響應面之后,為了求得培養(yǎng)基最佳濃度,對所得的回歸擬和方程分別對各自的變量求一階偏導數(shù),并令其為0得到三元一次方程組,求解此方程組可以得到最大抑制寄生曲霉生長率的最佳條件,即X1=20.91g(2.091%),X2=5.07g(0.507%),X3=8.24d,Y=72.23%。所以具有最大抑制寄生曲霉生產(chǎn)率的培養(yǎng)基組成與培養(yǎng)條件為:蔗糖為2.091%,KNO3為0.507%,含水量為60%,接種量為4%,培養(yǎng)溫度為35℃,pH為自然,培養(yǎng)時間為8.24d回歸模型驗證實驗:根據(jù)最優(yōu)培養(yǎng)基配方對模型進行驗證,寄生曲霉生長的抑制率為73.30%,實際值與預測值的誤差為+1.07%。該結(jié)果表明,響應面法優(yōu)化產(chǎn)海帶渣固體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基是