幾種抑菌劑對(duì)灰霉病的抑制作用

幾種抑菌劑對(duì)灰霉病的抑制作用

番茄是一種廣泛種植的作物。隨著反季節(jié)栽培面積的增加，番禺的運(yùn)輸在調(diào)節(jié)市場(chǎng)中發(fā)揮了積極作用。在番茄收獲后的儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中，收獲后的疾病會(huì)導(dǎo)致不同程度的水果腐爛，嚴(yán)重影響礦山和貨物的使用壽命，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。番茄采后病害的發(fā)生一般包括生理性病害和侵染性病害,灰霉病是常見的侵染性病害,病原真菌是灰葡萄孢(Botrytiscinerea),屬于鏈孢霉目、鏈孢霉科,分布廣泛易傳染,可感染多種植物引發(fā)灰霉病,而且可以二次侵染,加重病害流行［１］,造成果實(shí)的腐爛。與其它采后病害相比,灰葡萄孢不僅表現(xiàn)出明顯的潛伏侵染優(yōu)勢(shì),而且在低溫(4℃)條件下仍具有較強(qiáng)的致病性,能夠侵染200多種植物,致病力強(qiáng),具有能夠長(zhǎng)期潛伏侵染、適應(yīng)寄主生理狀態(tài)和降低寄主產(chǎn)生防御反應(yīng)的共生親和功能。因此,研究番茄采后灰霉病的防治具有重要意義。對(duì)于番茄采后病害,傳統(tǒng)的防治方法是以低溫結(jié)合化學(xué)抑菌劑進(jìn)行處理,但化學(xué)抑菌劑處理方法導(dǎo)致的病原菌抗藥性和農(nóng)殘問題備受爭(zhēng)議。近年來(lái),有研究［２］表明利用病原菌的拮抗菌進(jìn)行生物防治具有很好的效果,但由于拮抗菌抑菌所需濃度高、不具備廣譜抑菌性,難以完全取代傳統(tǒng)防治方法［３］。也有研究將采后熱處理［４］、涂膜處理等方法與上述防治方法結(jié)合［５］,得到了良好的效果。果蔬保鮮抑菌劑對(duì)于采后病害的防治具有顯著效果,并且具有低毒、高效、廣譜的優(yōu)點(diǎn)。GB2760-2011規(guī)定能夠在果蔬表面使用的抑菌劑有納他霉素、茶多酚、植酸、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、雙乙酸鈉和脫氫醋酸鈉。本試驗(yàn)擬采用菌絲生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)曲線法,研究幾種抑菌劑對(duì)灰葡萄孢菌絲和孢子的抑制作用,以篩選效果好的抑菌劑進(jìn)行復(fù)配,用以防治番茄采后灰霉病。1材料和方法1.1材料和試劑1.1.1茶多酚納他霉素:色譜級(jí),≥95%,上海伊卡生物技術(shù)有限公司;茶多酚:分析純,南通飛宇生物科技有限公司;山梨酸鉀、雙乙酸鈉、脫氫乙酸鈉:食品級(jí),南通奧凱生物技術(shù)開發(fā)有限公司。1.1.2細(xì)菌、設(shè)備及分散劑電子天平:FA2204B型,上海精科天美有限公司;自動(dòng)高壓滅菌鍋:LS-B75L-Ⅰ型,江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;冰箱:BCD-216型,青島海爾電冰箱有限公司;超凈工作臺(tái):SW-CJ-1D/1G型,蘇州市凈化設(shè)備有限公司;1.1.3病原菌的分離純化灰葡萄孢菌株:由本試驗(yàn)室從感染的番茄上分離獲得,經(jīng)純化、回接以及DNA鑒定確定病原菌。用于菌株分離的樣本,于貴州番茄灰霉病多發(fā)區(qū)域的田間采集。1.1.4培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂條20g,蒸餾水1000mL。1.2測(cè)試方法1.2.1生長(zhǎng)抑菌劑的制備(1)抑菌劑介質(zhì)平板的配制:采用試管二倍比稀釋法,將每種抑菌劑配成所需濃度梯度的藥液。然后按比例移取藥液及培養(yǎng)基,加到培養(yǎng)皿中,充分混勻,冷卻凝固,制成一定不同濃度梯度的抑菌劑介質(zhì)平板,現(xiàn)用現(xiàn)制。空白對(duì)照用無(wú)菌水代替藥液。(2)不同抑菌劑對(duì)番茄灰葡萄孢的最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定:根據(jù)一般抑菌劑量,植酸以2.5%的體積分?jǐn)?shù)作為最高濃度,其余以1g/L作為最高濃度,每種抑菌劑介質(zhì)平板設(shè)8個(gè)濃度梯度,采用試管二倍比稀釋法制成相應(yīng)濃度的抑菌劑介質(zhì)平板,每個(gè)濃度設(shè)3次平行,制好備用。準(zhǔn)備10６個(gè)/mL濃度的孢子懸浮液,吸取50μL至抑菌劑介質(zhì)平板表面,用玻棒均勻涂布,21℃下倒置恒溫培養(yǎng),直至對(duì)照組中菌落鋪滿平板,觀察生長(zhǎng)情況,記錄各抑菌劑的最低抑菌濃度(MIC)。(3)不同抑菌劑對(duì)番茄灰葡萄孢的毒力測(cè)定:采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定幾種抑菌劑的毒力回歸方程和抑制中濃度。根據(jù)以上試驗(yàn)8個(gè)濃度梯度間抑制率的顯著性差異和最低抑菌濃度(MIC),選擇合適的起始濃度,采用倍比稀釋法制成含毒介質(zhì)平板,設(shè)5個(gè)濃度梯度,每個(gè)濃度設(shè)3次平行,制好備用。然后沿灰葡萄孢菌落邊緣,取直徑7mm的菌塊,倒置接種于抑菌劑介質(zhì)平板中央,然后21℃恒溫培養(yǎng),直至對(duì)照組的菌落直徑生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿直徑1/2~2/3時(shí),記錄生長(zhǎng)情況,采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑,并按式(1)計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。所得數(shù)據(jù)利用Origin統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)算出毒力回歸方程和抑制中濃度EC５０。1.2.2運(yùn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)(1)灰葡萄孢孢子的收集和孢子懸浮液的配制:將菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央,22℃下培養(yǎng),至菌落表面大量產(chǎn)孢,向平皿中加入適量0.3%吐溫-80水溶液,并用刀片輕刮菌落表面,然后將含孢子的渾濁液震蕩10min,用雙層吸水紙過濾,濾去菌絲,然后低速(3000r/min)離心3min,棄上清,然后加入少量0.3%吐溫-80水溶液震蕩溶解,然后用血球計(jì)數(shù)板觀察計(jì)算孢子懸浮液的濃度,并將其稀釋至10５U/mL,現(xiàn)用現(xiàn)制［６］。(2)不同抑菌劑對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響:由于灰葡萄孢孢子在清水中幾乎不萌發(fā),因此采用在PDA培養(yǎng)基上涂布孢子懸浮液使其萌發(fā)的方法［７］。先將不同抑菌劑配制成濃度為EC５０和EC９０的含毒介質(zhì)平板(控制培養(yǎng)基厚度≤3mm),吸取0.1mL孢子懸浮液,均勻涂布于培養(yǎng)基表面,切取1.5cm×1.5cm左右大小的小塊,正面向上置于載玻片中央,然后放置于滅菌平板內(nèi)保濕,21℃黑暗培養(yǎng)觀察,培養(yǎng)5h后開始觀察孢子萌發(fā)情況,每隔1h記錄1次,記錄5次后停止,等24h后再觀察一次,并按式(2)計(jì)算孢子萌發(fā)率。每個(gè)處理設(shè)3次平行,隨機(jī)觀察不少于3個(gè)以上視野,觀察孢子總數(shù)不少于100個(gè),記錄孢子數(shù)和萌發(fā)孢子數(shù)。以孢子芽管超過孢子直徑視為萌發(fā)［８］。2結(jié)果與討論2.1鈉、鉀、雙乙酸鈉的抑制效應(yīng)從試驗(yàn)結(jié)果(表1)可以看出,7種抑菌劑對(duì)灰葡萄孢的生長(zhǎng)均有抑制效果,但抑菌效果有所差異:其中納他霉素的MIC最低,為62.5mg/L,對(duì)灰葡萄孢的生長(zhǎng)有很好的抑制效果;植酸和脫氫乙酸鈉對(duì)灰葡萄孢的生長(zhǎng)抑制效果中等;苯甲酸鈉、山梨酸鉀和雙乙酸鈉的抑制效果較差,濃度超過1g/L時(shí)才能達(dá)到完全抑制;而茶多酚雖有抑制,但是不能達(dá)到完全抑制。由表2可知,茶多酚對(duì)灰葡萄孢的抑制率隨濃度增加呈現(xiàn)一個(gè)先高后低的變化趨勢(shì),而其它6種抑菌劑抑制效果隨濃度變大而增加。其原因可能是由于茶多酚雖然具備一定的廣譜抑菌效果,但對(duì)于灰葡萄孢的生長(zhǎng)存在某種促進(jìn)作用,并與茶多酚的抑制作用相疊加,當(dāng)濃度較高時(shí),促進(jìn)作用大于抑制作用,表現(xiàn)出較弱的抑制;當(dāng)濃度較低時(shí),抑制作用和促進(jìn)作用都較低,表現(xiàn)出較弱的抑制;當(dāng)濃度適中時(shí),兩作用疊加產(chǎn)生的抑制作用最大,約為60%。2.2抑菌劑的篩選試驗(yàn)采用菌絲生長(zhǎng)速率法,通過選取抑制率適中的5個(gè)抑菌濃度進(jìn)行試驗(yàn),并對(duì)結(jié)果進(jìn)行線性擬合,求得毒力回歸方程和EC５０(表3)。比較可得幾種抑菌劑的EC５０:納他霉素<脫氫乙酸鈉<苯甲酸鈉<山梨酸鉀<雙乙酸鈉<植酸(折算濃度為687.9mg/L)。其中納他霉素和脫氫乙酸鈉的EC５０最低,比其它抑菌劑濃度低一個(gè)數(shù)量級(jí),僅需21.54mg/L和33.99mg/L,對(duì)灰葡萄孢的菌絲生長(zhǎng)有良好抑制效果。2.3不同抑菌劑對(duì)灰葡萄孢權(quán)的抑制率由于抑菌劑實(shí)際使用濃度多集中在抑制菌絲生長(zhǎng)的EC５０和EC９０之間,菌絲的抑制效果相近,所以比較當(dāng)各抑菌劑濃度為EC５０和EC９０時(shí),對(duì)孢子萌發(fā)的影響,便于綜合比較抑菌能力。抑菌劑對(duì)于孢子萌發(fā)的作用分為兩種:降低最終的孢子萌發(fā)率和延緩達(dá)到最終孢子萌發(fā)率的時(shí)間,即萌發(fā)速度。由表4可知,21℃黑暗培養(yǎng)灰葡萄孢孢子萌發(fā)速度萌發(fā)率在8~9h后變化基本趨于穩(wěn)定,并且由于24h后再萌發(fā)的孢子對(duì)整個(gè)菌落生長(zhǎng)影響較小,所以把24h后的萌發(fā)率看作最終的孢子萌發(fā)率,作為抑菌力大小的指標(biāo)進(jìn)行比較。2.3.1幾種抑菌劑對(duì)孢子抑制力的比較根據(jù)表4,將各抑菌劑EC９０濃度下的孢子萌發(fā)曲線進(jìn)行橫向比較,由圖1可知:1納他霉素可以完全抑制孢子萌發(fā);2植酸和山梨酸鉀不僅可以延緩萌發(fā)速度,同時(shí)可以大幅降低最終孢子萌發(fā)率,孢子萌發(fā)抑制率在50%以上;3苯甲酸鈉只能延遲灰葡萄孢孢子的萌發(fā)速度,對(duì)最終孢子的萌發(fā)率影響較小;4雙乙酸鈉和脫氫乙酸鈉對(duì)灰葡萄孢的萌發(fā)影響較弱;5而茶多酚可以大幅提高孢子萌發(fā)速度,處理組6h的萌發(fā)率已達(dá)91.7%,高于對(duì)照組24h的萌發(fā)率91.1%。2.3.2幾種抑菌劑濃度與抑制效果的關(guān)系根據(jù)圖2,將各抑制劑不同濃度下的孢子萌發(fā)曲線進(jìn)行縱向比較,可知各抑菌劑的抑菌效果對(duì)抑菌劑濃度的依耐性情況,其中:1納他霉素和山梨酸鉀在EC５０濃度下,依然對(duì)孢子萌發(fā)保持高抑制率;2茶多酚在低濃度0.05g/L下,能夠輕度延緩孢子的萌發(fā),與0.1g/L時(shí)促進(jìn)萌發(fā)效果相反,這與茶多酚對(duì)灰葡萄孢菌絲的抑制效果類似,其對(duì)孢子萌發(fā)的抑制或促進(jìn)與其濃度有關(guān);3植酸在EC５０濃度下,幾乎不影響孢子萌發(fā),失去了EC９０時(shí)的高抑制率;4苯甲酸鈉和脫氫乙酸鈉高低兩濃度對(duì)孢子萌發(fā)影響較弱,EC５０時(shí)可以少許提高萌發(fā)速度;5雙乙酸鈉EC５０時(shí)延緩孢子萌發(fā)速度比EC９０強(qiáng)。2.3.3比較幾種抑制劑對(duì)菌絲和孢子抑制力的區(qū)別由表4可知,在EC５０和EC９０濃度下,納他霉素均能完全抑制灰葡萄孢孢子的萌發(fā),其抑制效果甚至高于其對(duì)于菌絲生長(zhǎng)的抑制,說(shuō)明其抑菌能力偏向于對(duì)孢子萌發(fā)的抑制,這與張鵬的結(jié)論一致［９］。山梨酸鉀的抑制能力稍弱于納他霉素。其它抑菌劑僅能適當(dāng)降低孢子萌發(fā)速度,不能改變最終孢子萌發(fā)率。除納他霉素,其它抑菌劑對(duì)孢子萌發(fā)的抑制要遠(yuǎn)不如其對(duì)于菌絲生長(zhǎng)的抑制。這與文獻(xiàn)結(jié)果一致,抑制孢子萌發(fā)的MIC濃度一般要5~10倍于抑制菌絲生長(zhǎng)的MIC濃度,因?yàn)檎婢咦用劝l(fā)受生長(zhǎng)環(huán)境影響程度較小,而生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)于菌絲生長(zhǎng)的影響則較大。3幾種抑菌劑的敏感性由于植物病原真菌的侵染過程比較復(fù)雜,孢子的萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)這兩個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)影響病害的發(fā)病速度和嚴(yán)重程度,因此在篩選防治藥物的時(shí)候,不僅需要控制菌絲生長(zhǎng),也要限制孢子的萌發(fā)。對(duì)于番茄采后灰霉病病原的離體抑菌試驗(yàn),結(jié)果表明:納他霉素和脫氫乙酸鈉對(duì)灰葡萄孢M(jìn)IC和抑制中濃度最低,敏感性最強(qiáng);納他霉素和山梨酸鉀在EC５０和EC９０濃度下,對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制作用,但山梨酸鉀濃度偏大。綜合以上試驗(yàn),對(duì)幾種抑菌劑敏感性進(jìn)行比較后表明(表5),