酸性α醋酸萘酯酶染色法

酸性a醋酸萘酯酶染色法來源：生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中心發(fā)布時(shí)間：2010-04-04查看次數(shù)：1597一、 原理淋巴細(xì)胞內(nèi)含有許多種酶，如a醋酸荼酯酶(ANAE)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、P葡萄糖苷酸酶等。不同的淋巴細(xì)胞細(xì)胞亞群所含酶類及其含量各異，如淋巴母細(xì)胞富含ACP，而成熟的T淋巴細(xì)胞則顯示ANAE活性，因此可利用化學(xué)反應(yīng)作檢測(cè)。T淋巴細(xì)胞漿內(nèi)含有的酸性a醋酸荼酯酶(acidanaphthylacetateesterase，ANAE)，在弱酸性條件下，能使底物酸性a醋酸荼酯水解成醋酸和a荼酚，后者與六偶氮副品紅偶聯(lián)，生成不溶性的紅色沉淀物，沉積在T淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)酯酶所在的部位，經(jīng)甲基綠復(fù)染，反應(yīng)呈現(xiàn)單一或散在的顆?；虬邏K，顯棕紅色。B淋巴細(xì)胞則無此種反應(yīng)。因此ANAE染色法可作為鑒別T淋巴細(xì)胞的一種非特異性方法。此外，單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、酸性粒細(xì)胞及血小板等也可呈現(xiàn)酯酶染色陽性反應(yīng)，應(yīng)當(dāng)注意區(qū)分。二、 材料和方法(一)材料125%戊二醛溶液(固定液)在01mol/LpH值74磷酸鹽緩沖液9ml中加入25%戊二醛溶液1ml，混和，置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?副品紅液將副品紅4g加入2mol/L鹽酸100ml中，37C溶解過濾，4C冰箱保存?zhèn)溆谩?4%亞硝酸鈉溶液取亞硝酸鈉400mg，溶于蒸餾水10ml中，臨用前配制。4六偶氮副品紅溶液取新配制的亞硝酸鈉溶液3ml，慢慢滴入副品紅溶液3ml中，邊滴邊攪拌，此時(shí)有刺激性氣體產(chǎn)生。充分混合，1min后備用。a醋酸禁酯溶液：a醋酸荼酯2g乙二醇單甲醚100ml也可用丙酮100ml代替乙二醇單甲醚。0067(1/15)mol/LpH值76磷酸鹽緩沖液：甲液KH2PO4908g加蒸餾水至1，000ml乙液Na2HPO4974g加蒸餾水至1,000ml。（如為Na2HPO「12H2O則稱取2322g）取甲液13ml，加入乙液87ml，即為0067mol/LpH值76磷酸鹽緩沖液。7反應(yīng)液0067mol/LpH值76磷酸鹽緩沖液89ml六偶氮副品紅6ml（緩慢加入）a醋酸萘酯液25ml（緩慢加入）8甲基綠染色液充分混勻，調(diào)pH值58?60，臨用前配制。甲基綠1g蒸餾水100ml置37°C溶解，冰箱保存?zhèn)溆?。（二）方?分離單個(gè)核細(xì)胞取家兔肝素抗凝血1ml加入Hanks液1ml，加入到含有2ml淋巴細(xì)胞分層液（比重1077±0001）的離心管中，以2000r/min離心30min。洗滌后，加少量Hanks液，搖勻。2制片取上述細(xì)胞懸液1滴，加到潔凈玻片上，涂片，自然干燥。3固定和染色將制備的細(xì)胞涂片用25%戊二醛液4C固定10min，流水沖洗，待十。將玻片置于反應(yīng)液內(nèi)，37C孵育1h，取出用水沖洗，待干。4復(fù)染用甲基綠染色液染1min（或瞬時(shí)染色），水洗，吹干。油浸鏡下觀察計(jì)數(shù)。三、 結(jié)果判定鏡檢時(shí)，首先要判定是否為淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞經(jīng)ANAE染色后，可區(qū)分為兩大類：一類淋巴細(xì)胞的胞漿內(nèi)不見呈色物質(zhì)，為ANAE陰性細(xì)胞；另一類在胞漿中出現(xiàn)棕紅色物質(zhì)，為ANAE陽性細(xì)胞。根據(jù)呈色物質(zhì)的形態(tài)和分布又分為塊狀A(yù)NAE陽性淋巴細(xì)胞和點(diǎn)狀A(yù)NAE陽性淋巴細(xì)胞。ANAE陰性淋巴細(xì)胞呈黃綠色，胞漿內(nèi)無明顯著色顆粒。四、 注意事項(xiàng)1不同質(zhì)量的試劑，尤其是偶氮染料對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色、鮮艷程度、顆粒粗細(xì)和定位清晰程度等影響很大，應(yīng)加注意。2由于本反應(yīng)為酶化學(xué)反應(yīng)，反應(yīng)非常靈敏，各種條件應(yīng)嚴(yán)格掌握。尤其是試劑的pH值要求準(zhǔn)確，需用精密pH試紙或pH計(jì)測(cè)定。3配制反應(yīng)液時(shí)，各溶液混合，必須邊搖邊緩慢加入，若滴入過快，可出現(xiàn)沉淀，影響染色結(jié)果。4制片過程中，標(biāo)本要求盡快固定、干燥和沖洗。若時(shí)間過長(zhǎng)，可影響酯酶活性。5涂片插入染色缸時(shí)，要注意必須將標(biāo)