9種常用果實(shí)、種子類(lèi)中藥中核苷類(lèi)成分分析

9種常用果實(shí)、種子類(lèi)中藥中核苷類(lèi)成分分析

補(bǔ)虛證是一種糾正人體氣血不足的病理?xiàng)l件的藥物?，F(xiàn)代研究表明,補(bǔ)益類(lèi)中藥所含核苷類(lèi)、糖類(lèi)、氨基酸類(lèi)、無(wú)機(jī)元素等各類(lèi)水溶性成分在發(fā)揮補(bǔ)益功效中起著重要的作用,其中,核苷類(lèi)成分是生物細(xì)胞維持生命的重要物質(zhì),具有免疫調(diào)節(jié)、改善腦細(xì)胞代謝、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)等多種生理活性。重點(diǎn)核苷類(lèi)成分已作為藥品、保健品和食品添加劑服務(wù)于人口健康?！吨袊?guó)藥典》2010年版中以腺苷的含量測(cè)定作為冬蟲(chóng)夏草的質(zhì)量控制指標(biāo)。有報(bào)道將其作為冬蟲(chóng)夏草、靈芝等補(bǔ)益藥的質(zhì)量控制指標(biāo),此類(lèi)成分作為質(zhì)量控制的指標(biāo)越來(lái)越受到重視。本文采用高效液相色譜法測(cè)定了補(bǔ)益類(lèi)中藥大棗、枸杞子、覆盆子、桑椹、龍眼肉、菟絲子、韭菜子、五味子、核桃仁中的核苷類(lèi)成分,研究核苷類(lèi)成分在果實(shí)、種子類(lèi)補(bǔ)益藥中的組成及其含量,不同基源藥材中核苷類(lèi)成分的分布及其特點(diǎn)及各藥材所含核苷類(lèi)成分具有的生物活性與其補(bǔ)益功效間的關(guān)聯(lián)性。1q-500b超聲波粉碎機(jī)Waters2695高效液相色譜儀(四元泵,在線脫氣,柱溫箱,自動(dòng)進(jìn)樣),Waters2998二極管陣列檢測(cè)器,Empower2色譜工作站;StaoriusBT125D型1/10萬(wàn)電子天平(北京賽多利斯公司);KQ-500B超聲波清洗機(jī)(功率150W,昆山市超聲儀器有限公司);AnkeGL-16G-Ⅱ離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);EPED純水器(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)。胞苷(批號(hào)0001446223)、胸苷(批號(hào)079K0132)、尿嘧啶(批號(hào)073K406)購(gòu)自Sigma公司,純度98%;鳥(niǎo)嘌呤(批號(hào)140631-200904)、尿苷(批號(hào)887-200001)、肌苷(批號(hào)140669-200903)、鳥(niǎo)苷(批號(hào)879-200001)、腺嘌呤(批號(hào)866-200001)、環(huán)磷酸腺苷(批號(hào)140709-200602)、腺苷(批號(hào)879-200001)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,供含量測(cè)定用。藥材均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定,藥材信息見(jiàn)表1。2方法和結(jié)果2.1條件12.1.1乙酸銨梯度洗脫ApolloTM-C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相甲醇(A)-10mmol·L-1乙酸銨(B)梯度洗脫0~6min,1%A;6~15min,1%~4%A;15~25min,4%~8%A;25~60min,8%~20%A;60~68min,20%~98%A;68~77min,98%A;77~79min,98%~1%A,檢測(cè)波長(zhǎng)260nm,柱溫30℃,流量0.5mL·min-1,進(jìn)樣量10μL。2.1.2環(huán)磷酸腺苷的對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取尿嘧啶、胞苷、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、胸苷、環(huán)磷酸腺苷、腺苷對(duì)照品適量,加水制成含尿嘧啶(14.1mg·L-1)、胞苷(15.8mg·L-1)、鳥(niǎo)嘌呤(38.9mg·L-1)、尿苷(39.0mg·L-1)、肌苷(25.2mg·L-1)、鳥(niǎo)苷(37.1mg·L-1)、腺嘌呤(26.4mg·L-1)、胸苷(22.7mg·L-1)環(huán)磷酸腺苷(46.5mg·L-1)、腺苷(42.0mg·L-1)的混合對(duì)照品溶液,搖勻,即得,見(jiàn)圖1。2.1.3超聲提取法藥材45℃鼓風(fēng)干燥,置干燥器中冷卻至室溫,粉碎成粗粉,精密稱(chēng)取各藥材粗粉約1g,置具塞錐形瓶中,精密加水20mL,密塞,搖勻,稱(chēng)定質(zhì)量,超聲提取40min,放冷,再稱(chēng)定質(zhì)量,用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,3000r·min-1離心10min,上清液用0.45μm微孔濾膜濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。2.2方法研究2.2.1線性方程及相關(guān)系數(shù)法精密吸取2.1.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液加水稀釋至不同濃度,搖勻,制得對(duì)照品溶液系列,取10μL進(jìn)樣,測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo),對(duì)照品濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得各組分線性方程及相關(guān)系數(shù),結(jié)果見(jiàn)表2。該方法在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.2.2日內(nèi)精密度rsdn取2.1.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算各峰面積,考察日內(nèi)精密度,尿嘧啶、胞苷、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、胸苷、環(huán)磷酸腺苷、腺苷的日內(nèi)精密度RSD(n=6)分別為0.59%,0.75%,0.69%,0.57%,0.49%,0.61%,1.91%,0.49%,0.45%,1.37%。結(jié)果顯示儀器精密度良好。2.2.3樣品含量rsd精密稱(chēng)取大棗和韭菜子粉末分別平行6份,各約1g,按照2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別測(cè)定,計(jì)算峰面積,結(jié)果尿嘧啶、胞苷、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、胸苷、環(huán)磷酸腺苷、腺苷含量RSD分別為2.78%,1.66%,1.46%,1.89%,2.74%,1.49%,1.80%,2.34%,1.76%,1.58%。2.2.4sd大鼠尿監(jiān)外工酶譜檢測(cè)結(jié)果精密稱(chēng)取大棗、韭菜子粉末各約1g,按照2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,每隔2h進(jìn)樣測(cè)定,連續(xù)6次,結(jié)果尿嘧啶、胞苷、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、胸苷、環(huán)磷酸腺苷、腺苷峰面積的RSD分別為2.44%,1.74%,1.36%,2.13%,2.71%,1.00%,2.02%,1.38%,2.12%,1.43%。表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.2.5加樣回收及穩(wěn)定性精密稱(chēng)取大棗、韭菜子粉末約0.5g各6份,按各成分在藥材中含有量分別精密加入對(duì)照品溶液,按照2.1.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成加樣回收樣品液,測(cè)定含量,結(jié)果尿嘧啶、胞苷、鳥(niǎo)嘌呤、尿苷、肌苷、鳥(niǎo)苷、腺嘌呤、胸苷、環(huán)磷酸腺苷、腺苷的平均加樣回收率(n=6)和RSD分別為97.53%,1.21%;102.63%,2.47%;99.43%,2.38%;103.03%,1.68%;97.17%,2.57%;98.07%,1.35%;102.10%,2.83%;103.40%,1.87%;101.14%,1.03%;97.71%,0.89%。2.3樣品含量的測(cè)量取各藥材按照2.1.3項(xiàng)下操作,制成供試品溶液,以外標(biāo)法計(jì)算含量,每個(gè)樣品平行2份,結(jié)果見(jiàn)表3。3藥材、提取溶劑與提取時(shí)間的選擇核苷類(lèi)成分因植物基源不同其組成及其含量存在明顯差異。本文所測(cè)樣品分布于不同演化階段高等植物類(lèi)群9個(gè)科植物的果實(shí)和種子藥用部位,盡管樣本數(shù)有限,但分析結(jié)果因植物基源不同,其所含核苷類(lèi)成分及其含量呈現(xiàn)出顯著差異,反映出該類(lèi)成分在植物類(lèi)群中的分布可能具有間斷性和局限性。提示核苷類(lèi)成分可作為客觀評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的指標(biāo)性成分。應(yīng)給予關(guān)注和探討。核苷類(lèi)成分具有的生物活性與補(bǔ)益功效存在一定的關(guān)聯(lián)性。本文選擇的代表性果實(shí)種子類(lèi)藥材均為中醫(yī)臨床功效明確,人民生活中常用的補(bǔ)益類(lèi)中藥材。本文研究顯示尿苷在所測(cè)藥材中普遍分布,且含量較高,具有提高機(jī)體抗體水平,抗癌,抗病毒等作用;枸杞子中含有腺嘌呤,可刺激白細(xì)胞增生,用于防治由腫瘤化療、放療引起的白細(xì)胞減少癥;尿嘧啶在龍眼肉與桑椹藥材中分布,可能是其補(bǔ)血養(yǎng)血功效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一;五味子、覆盆子、菟絲子、韭菜子、核桃仁中均含有腺苷,該成分具有調(diào)節(jié)腎臟血流,控制腎素釋放,調(diào)節(jié)腎小球反饋系統(tǒng)等作用;推測(cè)腺苷可能與其補(bǔ)腎功效相關(guān)聯(lián)。提取溶劑的選擇,本文分別比較了純水、10%甲醇-水、20%甲醇-水、30%甲醇-水、40%甲醇-水、50%甲醇-水為提取溶劑,結(jié)果以純水提取核苷類(lèi)成分的溶出率最高,故選擇純水為提取溶劑;比較了水加熱提取和超聲提取,結(jié)果加熱提取核苷類(lèi)成分含量略低,故采用超聲提取的方法;以水為溶媒,進(jìn)行了30,40,50min超