生物技術(shù)制藥-(全套課件234P)-課件

第一章緒論第一節(jié)生物技術(shù)制藥的概念和內(nèi)容一、生物技術(shù)制藥的概念1、生物技術(shù)制藥：是指利用生物系統(tǒng)或通過生物反應(yīng)過程生產(chǎn)藥物的技術(shù)。1醫(yī)學(xué)資源第一章緒論第一節(jié)生物技術(shù)制藥的概念和內(nèi)容1醫(yī)學(xué)資源2、生物技術(shù)制藥學(xué)：是一門闡明生物藥物的研制原理、生產(chǎn)工藝及其分離純化技術(shù)的應(yīng)用學(xué)科?，F(xiàn)代生物技術(shù)制藥學(xué)是醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)、工程學(xué)與現(xiàn)代生物技術(shù)等相結(jié)合而形成的綜合學(xué)科。現(xiàn)代生物技術(shù)包括：基因工程，細(xì)胞工程，酶工程，發(fā)酵工程，生化分離工程。

2醫(yī)學(xué)資源2、生物技術(shù)制藥學(xué)：是一門闡明生物藥物的研制原理、生產(chǎn)工藝及3、生物藥物：是指以生物資源為原料或以生物技術(shù)為手段開發(fā)生產(chǎn)的用作疾病的預(yù)防、診斷和治療的醫(yī)藥品。4、生物新技術(shù)藥物：是指采用基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、抗體工程技術(shù)以及其他生物新技術(shù)開發(fā)生產(chǎn)的重組蛋白質(zhì)類、抗體類和核酸類藥物。3醫(yī)學(xué)資源3、生物藥物：是指以生物資源為原料或以生物技術(shù)為手段開發(fā)生產(chǎn)二、生物技術(shù)制藥的研究內(nèi)容和

涉及的技術(shù)領(lǐng)域1、發(fā)酵工程制藥是指利用微生物的代謝過程生產(chǎn)藥物的技術(shù)。利用發(fā)酵工程生產(chǎn)的藥物有：抗生素、維生素、氨基酸、核酸、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)和肽類、酶類、激素類和免疫調(diào)節(jié)劑類等。主要研究微生物優(yōu)良菌種的選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化和產(chǎn)品的分離純化等問題。

4醫(yī)學(xué)資源二、生物技術(shù)制藥的研究內(nèi)容和

涉及的技術(shù)領(lǐng)域1、發(fā)酵工程制2、基因工程制藥是指利用重組DNA技術(shù)改造生物物種的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)，借助重組生物細(xì)胞以生產(chǎn)藥物或預(yù)防、治療疾病的綜合技術(shù)。主要研究相應(yīng)目的基因的分離、鑒定和克隆，基因重組載體的構(gòu)建與導(dǎo)入，目的產(chǎn)物的表達(dá)及其分離純化等問題。5醫(yī)學(xué)資源2、基因工程制藥是指利用重組DNA技術(shù)改造生物物種的遺傳3、細(xì)胞工程制藥在細(xì)胞和細(xì)胞器水平上對生物的遺傳物質(zhì)改造的基礎(chǔ)上，利用動、植物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)來生產(chǎn)藥物的技術(shù)?？缮a(chǎn)天然動、植物藥物，疫苗，人類生理活性因子等重組DNA產(chǎn)品。主要研究動、植物細(xì)胞高產(chǎn)株系的選育、培養(yǎng)條件的優(yōu)化、新型生物反應(yīng)器的設(shè)計和應(yīng)用以及產(chǎn)物的分離純化等問題。6醫(yī)學(xué)資源3、細(xì)胞工程制藥在細(xì)胞和細(xì)胞器水平上對生物的遺傳物質(zhì)改4、酶工程制藥是指利用游離或固定化的酶為催化劑生產(chǎn)藥物的技術(shù)。作用：除能全程合成藥物分子外，還能用于藥物分子的轉(zhuǎn)化。特點(diǎn)：生產(chǎn)工藝結(jié)構(gòu)緊湊、專一性強(qiáng)，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高、容易回收，酶可重復(fù)利用等特點(diǎn)。任務(wù)：主要研究酶的來源，酶的分離制備，酶的固定化，酶反應(yīng)器及相應(yīng)操作條件的優(yōu)化等。7醫(yī)學(xué)資源4、酶工程制藥是指利用游離或固定化的酶為催化劑生產(chǎn)藥物的5、生化工程制藥是指利用生化分離技術(shù)從生物反應(yīng)液或天然生物資源中提取分離制備藥物的技術(shù)。主要研究藥用生物資源的選擇，藥用成分的種類、含量及其分布，藥物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及其提取純化工藝的優(yōu)化。8醫(yī)學(xué)資源5、生化工程制藥是指利用生化分離技術(shù)從生物反應(yīng)液或天然生作業(yè)：1、名詞解釋生物技術(shù)制藥，生物藥物，生物新技術(shù)藥物2、生物技術(shù)制藥涉及的技術(shù)領(lǐng)域

9醫(yī)學(xué)資源作業(yè)：9醫(yī)學(xué)資源第二節(jié)生物藥物的性質(zhì)與分類一、生物藥物的性質(zhì)1、藥理學(xué)特性（1）治療的針對性強(qiáng)，療效可靠。治療的生理、生化機(jī)制合理，如胰島素治療糖尿病。（2）藥理活性高。是從大量原料中精制出的高活性物質(zhì)。10醫(yī)學(xué)資源第二節(jié)生物藥物的性質(zhì)與分類一、生物藥物的性質(zhì)10醫(yī)學(xué)資源（3）毒副作用小，營養(yǎng)價值高。主要有蛋白質(zhì)、核酸、糖類和脂類等。（4）生理副作用常有發(fā)生。生物間存在種屬和個體差異，不同生物中活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)有很大差異，常出現(xiàn)免疫反應(yīng)、過敏反應(yīng)。11醫(yī)學(xué)資源（3）毒副作用小，營養(yǎng)價值高。11醫(yī)學(xué)資源2、在生產(chǎn)、制備中的特性（1）有效物質(zhì)含量低，雜質(zhì)種類多且含量高。如：胰腺中胰島素的含量僅為0.002%，生長激素抑制素（Somatostatin）在十萬只羊的下丘腦中僅含有1mg。（2）穩(wěn)定性差，易變性、易失活。生物藥物以其嚴(yán)格的空間構(gòu)象來維持其生物活性功能，具有特定的活性部位，一旦遭到破壞，就失去其藥理作用。

12醫(yī)學(xué)資源2、在生產(chǎn)、制備中的特性12醫(yī)學(xué)資源（3）易腐敗。

均為營養(yǎng)價值高的物質(zhì)，極易染菌、腐敗，從而造成有效物質(zhì)被破壞、失去活性。（4）對環(huán)境條件敏感，生產(chǎn)條件的變化對產(chǎn)品質(zhì)量的影響較大。（5）相對分子量較大（幾千至幾百萬），組成分復(fù)雜，常以多組分存在，大多是復(fù)雜蛋白質(zhì)的混合物。13醫(yī)學(xué)資源（3）易腐敗。13醫(yī)學(xué)資源（6）用量少，價值高。（7）注射用藥有特殊要求。生物藥物易被腸道中的酶所分解，給藥途徑主要是注射用藥。對藥品制劑的均一性、安全性、穩(wěn)定性、有效性等都有嚴(yán)格要求。14醫(yī)學(xué)資源（6）用量少，價值高。14醫(yī)學(xué)資源3、檢驗(yàn)上的特殊性由于生物藥物具有特殊的生理功能，因此生物藥物不僅要有理化檢驗(yàn)指標(biāo)，更要有生物活性檢驗(yàn)指標(biāo)，這是生物藥物生產(chǎn)開發(fā)的關(guān)鍵。15醫(yī)學(xué)資源3、檢驗(yàn)上的特殊性15醫(yī)學(xué)資源二、生物藥物的質(zhì)量保證許多生物藥物（細(xì)胞因子藥物）都參與人體機(jī)能的精細(xì)調(diào)節(jié)，任何性質(zhì)或數(shù)量上的偏差，都可能貽誤病情甚至造成嚴(yán)重危害，因此必須進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制。生物藥物的質(zhì)量控制包括以下幾項(xiàng)要點(diǎn)：產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)鑒別，純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和抑制性檢驗(yàn)或試驗(yàn)。16醫(yī)學(xué)資源二、生物藥物的質(zhì)量保證許多生物藥物（細(xì)胞因子藥物）都參與人體任何單一的分析方法都無法滿足對該類產(chǎn)品的檢測要求，需綜合化學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等多門學(xué)科的相關(guān)理論和技術(shù)。17醫(yī)學(xué)資源任何單一的分析方法都無法滿足對該類產(chǎn)品的檢測要求，需綜合化學(xué)1、鑒定方法（1）化學(xué)方法：生物藥物結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和純度的鑒別常采用化學(xué)方法，包括元素分析、紅外、紫外、核磁共振和質(zhì)譜等方法。（2）生化和生物學(xué)方法欲確定生物大分子的分子質(zhì)量、特定的空間立體結(jié)構(gòu)和特定的生理功能還需要結(jié)合生化和生物學(xué)方法加以確定。包括電泳方法、受體結(jié)合試驗(yàn)、免疫學(xué)分析方法等。

18醫(yī)學(xué)資源1、鑒定方法18醫(yī)學(xué)資源2、安全性評價通過動物試驗(yàn)來鑒定其安全性。（1）一般安全性要求：無菌、無病毒、無熱原、無致敏原等。（2）藥代動力學(xué)和毒理學(xué)研究。（3）致突變、致癌和致畸等遺傳毒理性質(zhì)的考察。19醫(yī)學(xué)資源2、安全性評價19醫(yī)學(xué)資源三、生物藥物的分類可按其原料來源、或按其生理功能和臨床用途、或按其生物化學(xué)性質(zhì)來分類。通常按其生物化學(xué)性質(zhì)來分類。20醫(yī)學(xué)資源三、生物藥物的分類可按其原料來源、或按其生理功能和臨床用途、（一）按所采用的技術(shù)手段來分1、生物技術(shù)藥物指采用DNA重組技術(shù)、蛋白質(zhì)工程技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù)研制的重組蛋白質(zhì)類、抗體類和核酸類藥物。21醫(yī)學(xué)資源（一）按所采用的技術(shù)手段來分1、生物技術(shù)藥物21醫(yī)學(xué)資源（1）重組蛋白質(zhì)類①細(xì)胞因子類：包括干擾素（INF）類、白細(xì)胞介素(IL)類、集落刺激因子(CSF)類、生長因子(GF)類、腫瘤壞死因子（TNF）類。②激素類：生長激素、胰島素等。③治療心腦血管病的活性蛋白質(zhì)類：包括溶解血栓類、血凝因子類。22醫(yī)學(xué)資源（1）重組蛋白質(zhì)類22醫(yī)學(xué)資源④治療和營養(yǎng)神經(jīng)的活性蛋白質(zhì)類：包括神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)素等。⑤可溶性細(xì)胞因子受體類：包括IL1受體、IL4受體、TNF受體等。⑥導(dǎo)向毒素類：包括IL2導(dǎo)向毒素、IL4導(dǎo)向毒素、單克隆抗體導(dǎo)向毒素等。23醫(yī)學(xué)資源④治療和營養(yǎng)神經(jīng)的活性蛋白質(zhì)類：包括神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因（2）抗體藥物由分化的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。（3）核酸藥物（基因藥物）分為反義核酸、核酶、脫氧核酶、抗基因寡核苷酸和基因疫苗與基因藥物。多用于有害基因的診斷與治療，阻斷有害基因的表達(dá)。24醫(yī)學(xué)資源（2）抗體藥物24醫(yī)學(xué)資源2、天然生化藥物采用生化分離技術(shù)直接從動物、植物、微生物和海洋生物中分離提取制備的天然藥物。25醫(yī)學(xué)資源2、天然生化藥物25醫(yī)學(xué)資源3、微生物藥物利用微生物發(fā)酵工程技術(shù)生產(chǎn)的藥物。4、合成與部分合成的生物藥物根據(jù)天然藥物的結(jié)構(gòu)，采用化學(xué)合成技術(shù)開發(fā)生產(chǎn)的藥物。26醫(yī)學(xué)資源3、微生物藥物26醫(yī)學(xué)資源（二）按功能和用途來分1、治療藥物用于疾病的治療（疑難病、多發(fā)?。缣悄虿?、免疫缺陷病、心腦血管病、腫瘤等。2、預(yù)防藥物用于傳染病的預(yù)防，包括各種疫苗、菌苗和類毒素等。27醫(yī)學(xué)資源（二）按功能和用途來分1、治療藥物27醫(yī)學(xué)資源3、診斷藥物用于疾病的臨床診斷。包括免疫診斷試劑、酶診斷試劑、抗體診斷試劑、基因診斷藥物和放射性診斷藥物等。28醫(yī)學(xué)資源3、診斷藥物28醫(yī)學(xué)資源（三）按藥物的化學(xué)本質(zhì)和生物化學(xué)性質(zhì)來分類1、氨基酸及其衍生物類谷氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、N-乙酰半胱氨酸、L-二羥基苯丙氨酸等20多種氨基酸及其衍生物，全世界總產(chǎn)量達(dá)數(shù)百萬噸。2、有機(jī)酸類乙酸、乳酸、蘋果酸、衣康酸、檸檬酸、葡萄糖酸、2-酮葡萄糖酸、D-異抗壞血酸、丙酮酸等。29醫(yī)學(xué)資源（三）按藥物的化學(xué)本質(zhì)和生物化學(xué)性質(zhì)來分類1、氨基酸及其衍生3、酮醇類乙醇、丙醇、丁醇、甘油等。4、維生素類維生素B2、維生素B12、β-胡蘿卜素、維生素C和維生素D的前體麥角醇等。30醫(yī)學(xué)資源3、酮醇類30醫(yī)學(xué)資源5、酶及輔酶類（1）酶類藥物①消化酶類：胰酶、胃蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等。②消炎酶類：溶菌酶、胰蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶等。③心血管疾病治療酶：彈性蛋白酶、激肽釋放酶（擴(kuò)張血管、降血壓）、尿激酶、纖溶酶、溶栓酶等。④抗腫瘤酶：L-天冬氨酸酶（治療淋巴瘤和白血?。?、谷氨酰胺酶、蛋氨酸酶、組氨酸酶等。

31醫(yī)學(xué)資源5、酶及輔酶類31醫(yī)學(xué)資源⑤其他酶類SOD：清除自由基、抗衰老，治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和放射病。PEG-腺苷脫氨酶：治療聯(lián)合免疫缺陷癥。RNA酶：用于抗RNA病毒。青霉素酶：治療青霉素過敏。32醫(yī)學(xué)資源⑤其他酶類32醫(yī)學(xué)資源（2）輔酶類NAD，NADP（輔酶Ⅱ），F(xiàn)MN（黃素單核苷酸），F(xiàn)AD（黃素腺嘌呤二核苷酸），輔酶Q10，輔酶A等。33醫(yī)學(xué)資源（2）輔酶類33醫(yī)學(xué)資源6、脂類（1）磷脂類：卵磷脂、腦磷脂，用于治療肝病、冠心病和神經(jīng)衰弱。（2）多價不飽和脂肪酸（PUFA）和前列腺素（PGI2）PUFA：有亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸，用于降血脂、降血壓和抗脂肪肝。PGI2：抗血栓、抗動脈粥樣硬化。34醫(yī)學(xué)資源6、脂類34醫(yī)學(xué)資源（3）膽酸類：去氧膽酸（治療膽囊炎），鵝去氧膽酸（溶膽結(jié)石、降低血膽固醇）。（4）固醇類：膽固醇（用于生產(chǎn)人工牛黃），麥角固醇，β-谷固醇（降低血膽固醇）（5）卟啉類：血紅素，膽紅素等（用于治療肝炎和腫瘤的診斷）35醫(yī)學(xué)資源（3）膽酸類：去氧膽酸（治療膽囊炎），鵝去氧膽酸（溶膽結(jié)石、7、多肽和蛋白質(zhì)類該類藥物多是人體內(nèi)的生理活性因子，包括激素、免疫調(diào)節(jié)劑和細(xì)胞生長因子等。該類藥物分子量不同、性質(zhì)差異較大。目前已用于臨床的有19種，即將上市的有20多種。36醫(yī)學(xué)資源7、多肽和蛋白質(zhì)類36醫(yī)學(xué)資源（1）蛋白質(zhì)類：有血清白蛋白、丙種球蛋白和胰島素等。（2）多肽類：有激素和免疫調(diào)節(jié)劑等。37醫(yī)學(xué)資源（1）蛋白質(zhì)類：有血清白蛋白、丙種球蛋白和胰島素等。37醫(yī)學(xué)（3）細(xì)胞生長因子類：動物細(xì)胞分泌的具有多種生物活性的因子，對人類和動物細(xì)胞的生長與分化有重要調(diào)節(jié)作用。有干擾素（IFN）、白細(xì)胞介素（IL）、腫瘤壞死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）等四大類系列數(shù)十種細(xì)胞因子。如白細(xì)胞介素-2（IL-2）用于治療腎細(xì)胞癌，即將上市的有IL-3、IL-6等。α-2a干擾素、α-2b干擾素用于治療毛細(xì)胞性白血病，即將上市的有α-干擾素N3、β-1b干擾素、γ-干擾素和γ-1b干擾素等。38醫(yī)學(xué)資源（3）細(xì)胞生長因子類：動物細(xì)胞分泌的具有多種生物活性的因子，8、核酸類及其降解物和衍生物類（1）核酸類：從牛、豬的肝臟中提取的RNA用于肝癌、肝硬化的治療。免疫RNA（iRNA）用于腫瘤的免疫治療。（2）多聚核苷酸：聚肌苷酸和巰基聚胞苷酸用于抗病毒、抗腫瘤。（3）核苷、核苷酸及其衍生物：ATP、CTP、cAMP、CDP-膽堿等，可將它們經(jīng)化學(xué)修飾后用于治療腫瘤和抗病毒。39醫(yī)學(xué)資源8、核酸類及其降解物和衍生物類39醫(yī)學(xué)資源9、糖類活性多糖有抗凝血、降血脂、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、升高白細(xì)胞和抗炎等作用。有銀耳多糖、靈芝多糖、茯苓多糖、香菇多糖、肝素、透明質(zhì)酸、殼聚糖、刺參多糖等。40醫(yī)學(xué)資源9、糖類40醫(yī)學(xué)資源10、生物制品類指從微生物、原蟲、動物或人體材料直接制備或用現(xiàn)代生物技術(shù)、化學(xué)方法制成的作為預(yù)防、治療和診斷特定傳染病或其他疾病的制劑。生物制品用于各種傳染病的診斷、預(yù)防和治療，包括各種疫苗、菌苗和類毒素。41醫(yī)學(xué)資源10、生物制品類41醫(yī)學(xué)資源作業(yè)：1、闡述生物藥物的特性。2、闡述生物藥物的質(zhì)量保證措施。42醫(yī)學(xué)資源作業(yè)：42醫(yī)學(xué)資源第二章基因工程制藥第一節(jié)基因工程制藥概述一、基因工程的概念基因工程（Geneengineering）又稱DNA重組技術(shù)（DNArecombinationtechnology）：是指按人的意志，將某一生物體（供體）的遺傳信息（目的基因）在體外經(jīng)人工與載體DNA重組，構(gòu)成重組DNA，然后轉(zhuǎn)入到另一生物體（受體）細(xì)胞中，使被引入的外源DNA片段（目的基因）在受體細(xì)胞內(nèi)得以表達(dá)和遺傳?；蚬こ淌悄苋斯ざㄏ蚋脑焐镞z傳性狀的育種新技術(shù)。

43醫(yī)學(xué)資源第二章基因工程制藥第一節(jié)基因工程制藥概述43醫(yī)學(xué)資源二、基因工程技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)1、它能從極其復(fù)雜的各種生物細(xì)胞內(nèi)獲得所需的目的基因，并將此目的基因在體外進(jìn)行剪切、拼接、重組，并轉(zhuǎn)入到受體細(xì)胞中，從而合成出人們所需的新產(chǎn)物。2、它能使帶有各種各樣遺傳信息的DNA片段越過不同生物物種間特異的細(xì)胞壁而轉(zhuǎn)入到完全不同的生物體內(nèi)，定向地控制、修飾和改變受體的遺傳和變異，從而創(chuàng)造出自然界所未有的具有新的遺傳性狀的生物新種，并增產(chǎn)出數(shù)百數(shù)千倍人們所需的生物新藥。44醫(yī)學(xué)資源二、基因工程技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)44醫(yī)學(xué)資源三、在生物技術(shù)體系中的作用基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程和生化工程是組成生物技術(shù)的主體，它們是相互依賴、相輔相成的。在這些技術(shù)體系中基因工程起著主導(dǎo)作用，因?yàn)橹挥杏没蚬こ谈脑爝^的生物細(xì)胞，才能賦予其他技術(shù)以新的生命力。生物藥物1997年在國際市場銷售額有260億美元，有50多種投放市場，正在臨床試驗(yàn)的有200多種，其中有100多種很快上市。45醫(yī)學(xué)資源三、在生物技術(shù)體系中的作用45醫(yī)學(xué)資源第二節(jié)基因工程常用的工具酶和克隆載體一、基因工程制藥中常用的工具酶基因工程的重要特點(diǎn)之一是在體外實(shí)行DNA分子的切割和重新連接。例如：要獲得所需藥物的目的基因并要將此特定目的基因與載體DNA連接在一起，在很大程度上依賴于某些工具酶。因此，基因工程要得以實(shí)施，首先要為體外操作DNA分子提供一系列的工具酶。46醫(yī)學(xué)資源第二節(jié)基因工程常用的工具酶和克隆載體一、基因工程制藥中常其中最重要的是能接一定的核苷酸序列切斷DNA分子的限制酶，并能把兩種DNA片段連接起來的DNA連接酶。隨著越來越多的酶分子被人們發(fā)現(xiàn)，這類工具酶的數(shù)量和用途不斷增加，許多廠商已能生產(chǎn)并廣泛供應(yīng)各種優(yōu)質(zhì)工具酶，這不僅大大簡化了分子克隆的操作，而且拓寬了基因工程的研究領(lǐng)域。47醫(yī)學(xué)資源其中最重要的是能接一定的核苷酸序列切斷DNA分子的限制酶，并（一）限制酶（Restrictionenzymes）限制性核酸內(nèi)切酶，是一類專一性很強(qiáng)的核酸內(nèi)切酶，專一地識別和作用于DNA分子上特定的核苷酸序列，切斷DNA雙鏈。對DNA分子上特定核苷酸序列和堿基作用的專一性，以及對磷酸二酯鍵斷裂方式上的特殊性。48醫(yī)學(xué)資源（一）限制酶（Restrictionenzymes）48醫(yī)1、限制酶的種類（1）Ⅰ型酶：早期提取的酶類，是一類復(fù)雜的多功能酶，在基因工程上應(yīng)用價值不大。49醫(yī)學(xué)資源1、限制酶的種類49醫(yī)學(xué)資源（2）Ⅱ型酶：相對分子量較小，2萬～10萬，是簡單的單功能酶，作用時無需輔助因子或只需Mg2+。特點(diǎn)：能識別雙鏈DNA上特異的核苷酸序列，底物作用的專一性強(qiáng)，而且其識別序列與切斷序列相一致。自20世紀(jì)70年代以來，從幾乎所有細(xì)菌的屬、種中都發(fā)現(xiàn)至少一種Ⅱ型限制酶，同一品系的菌株中也常有識別不同序列的兩種酶。至今已發(fā)現(xiàn)和分離成功的Ⅱ型酶大約有500種，其中有些已商品化。50醫(yī)學(xué)資源（2）Ⅱ型酶：相對分子量較小，2萬～10萬，是簡單的單功能酶2、限制酶的命名是以寄主微生物屬名的第一個字母（大寫）和種名的前兩個字母（小寫）寫成斜體字的3個字母的縮寫，菌株名的第一個字母以非斜體加在這三個字母的后面。若同一菌株里有幾種不同的限制酶時，則以羅馬數(shù)字加以區(qū)分。例：HindⅢ限制酶是從流感嗜血桿菌菌株Haemophilus

influenzaed中分離出來的第三種限制酶。EcoRⅠ表示從大腸埃氏菌菌株RYB中分離出來的第一種限制酶。51醫(yī)學(xué)資源2、限制酶的命名51醫(yī)學(xué)資源屬名種名菌株名Haemophilus

influenzae

嗜血流感桿菌株d

HindIII同一菌株中分離出的第三個限制性核酸內(nèi)切酶52醫(yī)學(xué)資源屬名種名3、限制酶的特性（1）不同限制酶能專一地識別不同的特異核苷酸序列（核苷酸序列不同，序列大小不同）EcoRⅠ：5‵-GAATTC-3‵HaeⅠ:5‵-(A/T)GGCC(A/T)-3‵AsuⅠ:5‵-GGNCC-3‵EcoRⅡ：5‵-CC(A/T)GG-3‵MboⅠ：5‵-GATC-3‵53醫(yī)學(xué)資源3、限制酶的特性53醫(yī)學(xué)資源（2）各種限制酶的識別序列都具有回文結(jié)構(gòu)限制酶所識別序列的兩條核苷酸鏈中的堿基排列次序是完全相同的，即正讀與反讀都相同，這種結(jié)構(gòu)稱回文結(jié)構(gòu)（Palidromicstructure）。例：BamHⅠ的識別序列：5‵-GGATCC-3‵3‵-CCTAGG-5‵54醫(yī)學(xué)資源（2）各種限制酶的識別序列都具有回文結(jié)構(gòu)54醫(yī)學(xué)資源EcoRⅠ的識別序列：(EcoRⅠ的切割位點(diǎn))5‘-GCT

GAATTC

GAG-3’3‘-CGA

CTTAAG

CTC-5’(EcoRⅠ的切割位點(diǎn))55醫(yī)學(xué)資源EcoRⅠ的識別序列：(EcoRⅠ的切割位點(diǎn))5‘（3）各種限制酶的切割類型是各式各樣的，切后形成各種粘性或平整末端。①一種是限制酶錯位切斷DNA雙鏈而形成彼此互補(bǔ)的單鏈末端，稱粘性末端（Cohesiveends）如限制酶EcoRⅠ（大多限制酶都是這種切割方式）：5‵-G↓AATTC-3‵→5‵-GAATTC-3‵3‵-CTTAA↑G-5‵3‵-CTTAAG-5‵這種具有粘性末端的DNA片段很容易通過單鏈區(qū)的堿基配對而連接在一起，產(chǎn)生線狀或環(huán)狀DNA分子。56醫(yī)學(xué)資源（3）各種限制酶的切割類型是各式各樣的，切后形成各種粘性或平EcoRⅠ產(chǎn)生的5′粘性末端5’-G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G-3’3’-C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C-5’EcoRI37℃5‘-G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G-3’3‘-C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

-5’

57醫(yī)學(xué)資源EcoRⅠ產(chǎn)生的5′粘性末端5’-G-C-T-G-A-Pst

Ⅰ產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘--G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C--5’Pst

Ⅰ37℃5‘--G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C--5’

58醫(yī)學(xué)資源PstⅠ產(chǎn)生的3‘粘性末端5‘--G-C-T-C-T②另一種是限制酶在同一位點(diǎn)平齊切斷DNA兩條鏈而形成的雙鏈末端，稱為平整末端（Flushends）。如限制酶AluⅠ：5‵-AG↓CT-3‵→5‵-AGCT-3‵3‵-TC↑GA-5‵3‵-TCGA-5‵59醫(yī)學(xué)資源②另一種是限制酶在同一位點(diǎn)平齊切斷DNA兩條鏈而形成的雙鏈末PvuII產(chǎn)生的平整末端5‘--

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C--5’PvuII37℃5‘--G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C--5’

60醫(yī)學(xué)資源PvuII產(chǎn)生的平整末端5‘--G-C-T-C-A-根據(jù)限制酶的識別序列和切點(diǎn)位置，還可以發(fā)現(xiàn)下面兩種情況：①識別序列不同的限制酶，切割后有可能產(chǎn)生相同的粘性末端：BamHⅠ:5‵-G↓GATCC-3‵→5‵-G5‵-GATCC-3‵3‵-CCTAG↑G-5‵3‵-CCTAG-5‵G-5‵BglⅡ：5‵-A↓GATCT-3‵→5‵-A5‵-GATCT-3‵3‵-TCTAG↑A-5‵3‵-TCTAG-5‵A-5‵MboⅠ：5‵-↓GATC-3‵→5‵-GATC-3‵3‵-CTAG↑-5‵3‵-CTAG-5‵61醫(yī)學(xué)資源根據(jù)限制酶的識別序列和切點(diǎn)位置，還可以發(fā)現(xiàn)下面兩種情況：61以上三種限制酶識別不同的核苷酸序列，但切割后產(chǎn)生相同的5‵-GATC粘性末端。像這樣一類限制酶稱同切口限制酶或同裂酶。這類酶的DNA酶解片段都可在體外互相重組，在DNA連接酶作用下，可以得到嵌合的重組DNA，稱為異源二聚體。這種二聚體不再能被原來的兩種限制酶所識別，有利于得到大量重組DNA分子。

62醫(yī)學(xué)資源以上三種限制酶識別不同的核苷酸序列，但切割后產(chǎn)生相同的5‵-②來源不同的限制酶其識別序列相同，但由于其切點(diǎn)位置不同，因而產(chǎn)生的切割末端不同。例：XmzⅠ:5‵-C↓CCGGG-3‵→5‵-C5‵-CCGGG-3‵3‵-GGGCC↑C-5‵3‵-GGGCCC-5‵

SmaⅠ:5‵-CCC↓GGG-3‵→5‵-CCC-3‵5‵-GGG-3‵3‵-GGG↑CCC-5‵3‵-GGG-5‵3‵-CCC-5‵

63醫(yī)學(xué)資源②來源不同的限制酶其識別序列相同，但由于其切點(diǎn)位置不同，因而（4）在標(biāo)準(zhǔn)條件下，每種限制酶都有嚴(yán)格的識別序列。某些限制酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，可能導(dǎo)致酶的識別序列特異性發(fā)生改變，會嚴(yán)重干擾限制酶在DNA重組中的正常應(yīng)用。因此，所有限制酶反應(yīng)都應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行。特別要控制pH值、離子強(qiáng)度、二價離子濃度等反應(yīng)條件。64醫(yī)學(xué)資源（4）在標(biāo)準(zhǔn)條件下，每種限制酶都有嚴(yán)格的識別序列。64醫(yī)學(xué)資在甘油濃度、離子強(qiáng)度、pH值、有機(jī)溶劑、二價陽離子濃度、酶與DNA的比例等參數(shù)單獨(dú)或同時發(fā)生改變的非標(biāo)準(zhǔn)條件下，會導(dǎo)致限制酶識別序列的特異性發(fā)生改變，在DNA內(nèi)產(chǎn)生附加切割，稱限制酶的第2活性或星活性。產(chǎn)生第2活性的酶常在酶名稱的右上角加星號“*”。例：EcoRⅠ:5‵-GAATTC-3‵EcoRⅠ*:5‵-AATT-3‵65醫(yī)學(xué)資源在甘油濃度、離子強(qiáng)度、pH值、有機(jī)溶劑、二價陽離子濃度、酶與（二）DNA連接酶能將兩段DNA拼接起來的酶叫DNA連接酶。這類酶的發(fā)現(xiàn)和分離純化，使兩個DNA片段在體外連接形成重組DNA分子成為可能。66醫(yī)學(xué)資源（二）DNA連接酶66醫(yī)學(xué)資源DNA連接酶的作用催化DNA5‵磷酸和3‵羥基之間形成磷酸二脂鍵5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPnickPOHnickDNA連接酶67醫(yī)學(xué)資源DNA連接酶的作用催化DNA5‵磷酸和3‵羥基之間形成1、T4噬菌體DNA連接酶來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌，分子量68000u，催化DNA5‵磷酸和3‵羥基之間形成磷酸二脂鍵。（1）連接帶有匹配粘性末端的雙鏈DNA分子，也可連接帶切口的DNA。在PEG低濃度下可促進(jìn)DNA分子間的連接。（2）連接平整末端的雙鏈DNA分子，反應(yīng)速率要比上述粘性末端連接慢得多。但在單價陽離子和低濃度PEG存在的條件下可大大提高平整末端連接的速率。68醫(yī)學(xué)資源1、T4噬菌體DNA連接酶68醫(yī)學(xué)資源T4-DNA連接酶催化粘性末端的連接5’-G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G-3’3’-C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C-5’T4-DNA連接酶5‘-G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G-3’3‘-C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

-5’

69醫(yī)學(xué)資源T4-DNA連接酶催化粘性末端的連接5’-G-C-T-GT4-DNA連接酶催化平整末端的連接5‘--

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C--5’T4-DNA連接酶5‘--G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G--3’3‘--C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C--5’

PEG70醫(yī)學(xué)資源T4-DNA連接酶催化平整末端的連接5‘--G-C-T-2、大腸桿菌DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶可催化互相匹配的粘性末端的5‵突出端與3‵末端的雙鏈DNA之間形成磷酸二酯鍵，但需NAD作輔助因子。該酶一般不能催化平整末端雙鏈DNA間的連接，但在PEG或Ficoll(聚蔗糖)存在下也能催化平整末端連接。71醫(yī)學(xué)資源2、大腸桿菌DNA連接酶71醫(yī)學(xué)資源（三）DNA聚合酶（DNApolymerase）是能夠催化DNA復(fù)制和修復(fù)DNA分子損傷的一類酶。在基因工程操作中用于DNA的體外合成反應(yīng)。這類酶作用時大多需要DNA模板并優(yōu)先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率較低。另有一種聚合酶，即反轉(zhuǎn)錄酶，是依賴于RNA的DNA聚合酶，可優(yōu)先拷貝RNA。72醫(yī)學(xué)資源（三）DNA聚合酶（DNApolymerase）72醫(yī)學(xué)資1、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ分子量109000u，由一條多肽鏈組成，約有1000個氨基酸，酶分子中含有一個雙硫鍵和一個巰基，還含鋅離子，基本是一個橢圓形的結(jié)構(gòu)，是一種多功能酶。73醫(yī)學(xué)資源1、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ73醫(yī)學(xué)資源（1）該酶具有三種活力：①5‵→3‵聚合酶活力：底物為單鏈DNA模板及帶3‵羥基的DNA引物，聚合脫氧核苷酸，使之逐個接到引物上。②5‵→3‵外切酶活力：底物是雙鏈DNA或RNA﹕DNA的雜交體，從5‵端降解DNA或RNA。③3‵→5‵外切核酸酶活力：底物是帶有3‵羥基端的雙鏈DNA或單鏈DNA，從3‵羥基端逐個切除核苷酸降解DNA。5‵—GATTCGTAACGGTA-OH-3‵3‵—CTAAGCATTGCCAT—5‵74醫(yī)學(xué)資源（1）該酶具有三種活力：74醫(yī)學(xué)資源大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用5‘→3‘的DNA聚合酶活性3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OHDNA聚合酶Ⅰ5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH75醫(yī)學(xué)資源大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用5‘→3‘的DNA聚合酶活性3（2）該酶主要用途是采用切口平移法，以放射性脫氧核苷酸置換原來的dNTP標(biāo)記DNA，從而制作DNA探針。此外，用于修補(bǔ)DNA缺損部位的空隙。5‵-GATT-3‵5‵-CGTAACGCCA-3‵3‵-CTAAGCATTGAGCATTGCGGT-5‵5‵-GATTCGTAACTCG-3‵5‵-CA-3‵3‵-CTAAGCATTGAGCATTGCGGT-5‵76醫(yī)學(xué)資源（2）該酶主要用途是采用切口平移法，以放射性脫氧核苷酸置換原2、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）Klenow酶：大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。Klenow酶仍擁有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。77醫(yī)學(xué)資源2、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）KleKlenow酶的基本作用：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測定DNA序列78醫(yī)學(xué)資源Klenow酶的基本作用：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端Klenow酶的作用一補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端

5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C

…5’

79醫(yī)學(xué)資源Klenow酶的作用一補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5‘粘性末端Klenow酶的作用二

DNA片段的同位素末端標(biāo)記5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C

…5’

Klenowa-32P-pppdN5‘…

G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G

…3’3‘…

C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’

80醫(yī)學(xué)資源Klenow酶的作用二5‘…G-C-T-G-OH3、TaqDNA聚合酶是從極度嗜熱的水生棲熱菌（Thermasaquaticus）中分離純化而來的，是一種耐熱的聚合酶，分子量6500u。目前生產(chǎn)并出售的是AmpliTaqTMDNA聚合酶。該酶具有5‵→3‵聚合酶活力和依賴于聚合作用的5‵→3‵外切酶活力。該酶最佳作用溫度75~80℃，為避免引物在模板上解離，往往要在低于最適溫度條件下起始聚合反應(yīng)。該酶可用于對DNA進(jìn)行測序，但主要用于PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)），對DNA分子的特定序列（目的基因）進(jìn)行體外擴(kuò)增。81醫(yī)學(xué)資源3、TaqDNA聚合酶81醫(yī)學(xué)資源4、T4噬菌體DNA聚合酶來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌，具有5‵→3‵聚合酶活力和3‵→5‵外切酶活力。作用：①補(bǔ)平和標(biāo)記限制酶消化DNA后產(chǎn)生的3‵凹端。5‵-G-3‵5‵-GGATC-3‵3‵-CCTAG-5‵3‵-CCTAG-5‵②對帶有3‵突出端的DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記。③標(biāo)記用作探針的DNA片段。④將雙鏈DNA末端轉(zhuǎn)化成平端。82醫(yī)學(xué)資源4、T4噬菌體DNA聚合酶82醫(yī)學(xué)資源T4-DNA聚合酶的作用一切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G

…3’3‘

…

C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’T4-DNA聚合酶5‘

…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘

…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C

…5’83醫(yī)學(xué)資源T4-DNA聚合酶的作用一5‘…G-C-T-C-T-T4-DNA聚合酶的作用二

DNA片段的同位素末端標(biāo)記5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApol5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OH

HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘

T4-DNApolMg2+

a-32P-dNTP5‘

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘

84醫(yī)學(xué)資源T4-DNA聚合酶的作用二5‘G-C-T-C-A-G-C5、經(jīng)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶（測序酶）來源于T7噬菌體感染的大腸桿菌，具有較強(qiáng)的持續(xù)的5‵→3‵聚合酶活力和3‵→5‵外切酶活力。它所催化合成的DNA平均長度要比其他DNA聚合酶大得多，可用于長段模板上引物的延伸反應(yīng)。經(jīng)化學(xué)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶商品名為測序酶，去除了3‵→5‵外切酶活力，保持了5‵→3‵聚合酶活力，它的持續(xù)合成能力很強(qiáng)。主要用于Sanger雙脫氧末端終止法對長段DNA分子的測序?，F(xiàn)又用基因工程手段生產(chǎn)出一種改進(jìn)的測序酶2.0版，完全喪失了外切酶活力。

85醫(yī)學(xué)資源5、經(jīng)修飾的T7噬菌體DNA聚合酶（測序酶）85醫(yī)學(xué)資源6、反轉(zhuǎn)錄酶該酶為依賴于RNA的DNA聚合酶，來源于鼠或禽反轉(zhuǎn)錄病毒。該酶主要以mRNA為模板轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)雙鏈cDNA，也可用于制備雜交用探針和標(biāo)記帶5‵突出端的DNA片段。86醫(yī)學(xué)資源6、反轉(zhuǎn)錄酶86醫(yī)學(xué)資源反轉(zhuǎn)錄酶的作用一以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-18反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+dNTP3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTT3’cDNA87醫(yī)學(xué)資源反轉(zhuǎn)錄酶的作用一以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈反轉(zhuǎn)錄酶的作用二雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈3’RNA5’DNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶3’RNA5’DNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶5’DNA3’88醫(yī)學(xué)資源反轉(zhuǎn)錄酶的作用二3’RNA5’DNA3’5’反轉(zhuǎn)錄酶（四）核酸酶1、單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）核酸外切酶VII雙向外切DNA單鏈5’3’5’3’ExoVII5’5’3’3’89醫(yī)學(xué)資源（四）核酸酶1、單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVI2、雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）核酸外切酶III特異性地從3‘端外切雙鏈DNA5’3’3’5’ExoIIIMg2+5’5’3’3’90醫(yī)學(xué)資源2、雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）核酸外3、雙鏈核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）l核酸外切酶特異性地從5‘端外切雙鏈DNA5’3’3’5’lExoMg2+3’3’5’5’91醫(yī)學(xué)資源3、雙鏈核酸外切酶：l核酸外切酶（lExo）l核酸外4、單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍反應(yīng)必需有Zn2+最適pH范圍為4.0-4.3需要NaCl10-300mMol降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍92醫(yī)學(xué)資源4、單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性降解S1核酸酶的基本反應(yīng)一內(nèi)切單鏈DNA或RNA，產(chǎn)生帶5‘磷酸的單核苷酸。5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs93醫(yī)學(xué)資源S1核酸酶的基本反應(yīng)一5‘…G-C-T-C-A-G-C-S1核酸酶的基本反應(yīng)二內(nèi)切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-GC-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘

nick5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-CA-C-C-T-C-A…5‘

gapS1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G3‘…C-G-A-G-T-CT-G-G-A-G-T…3’A-C-C-T-C-A…5‘

94醫(yī)學(xué)資源S1核酸酶的基本反應(yīng)二5‘…G-C-T-C-A-G5、單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶主要是3‘核酸外切酶活力，同時也具有DNA內(nèi)切酶活力。可從線狀DNA兩條鏈的3‘端迅速去除單核苷酸，隨后在形成的互補(bǔ)單鏈上進(jìn)行緩慢的內(nèi)切酶降解。DNAorRNABal315‘dNMPs或5‘NMPsBal31Bal3195醫(yī)學(xué)資源5、單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶主要是3（五）核酸修飾酶1、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）TdT的基本特性：不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTPs。作用底物：帶3‘OH的單鏈DNA或雙鏈DNA。5‘pOH3‘

3‘HOp5‘

TdTCo2+

dATP5‘p3‘HOp5‘

AAAAAAAAAAAA

OH3‘

96醫(yī)學(xué)資源（五）核酸修飾酶1、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）TdTdT的基本作用：5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+,

dATP5‘pp5‘

AAAAAAAAAA

OH3‘

3‘HO

AAAAAAAAAAA5‘p3‘HOOH3‘

p5‘

TdTCo2+,

dATP5‘pp5‘

AAAAAAAAAA

OH3‘

3‘HO

AAAAAAAAAAA97醫(yī)學(xué)資源TdT的基本作用：5‘p3‘HOOH3‘p5‘2、堿性磷酸單酯酶來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP）,特異性強(qiáng)；來自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP），耐熱；作用：催化去除單鏈或雙鏈DNA或RNA分子中的5‘p，即脫磷酸作用，防止DNA片段自身環(huán)化。DNAorRNA5‘pOH3‘

5‘HOOH3‘

5‘pppdN5‘pppNBAP

/CIP5‘HOdN5‘HON98醫(yī)學(xué)資源2、堿性磷酸單酯酶來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP3、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的基本作用：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷酸用于DNA探針的末端同位素標(biāo)記。5‘HO3‘HOOH3‘

OH5‘

T4-PNPMg2+

pppATP（g-32P-ATP）OH3‘

3‘HO5‘

pp

5‘

99醫(yī)學(xué)資源3、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）T4-PNP的二、基因工程常用的克隆載體基因工程的一個重要環(huán)節(jié)是目的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體（Vector）之設(shè)計和運(yùn)用。因?yàn)槟康幕颍ㄍ庠碊NA）一般難以進(jìn)入不同種屬的宿主細(xì)胞中，即使能單獨(dú)進(jìn)入也不能進(jìn)行復(fù)制增殖和表達(dá)，它必須與具有自我復(fù)制能力的DNA載體共價結(jié)合后才能被復(fù)制和表達(dá)。100醫(yī)學(xué)資源二、基因工程常用的克隆載體基因工程的一個重要環(huán)節(jié)是目的基因這種在細(xì)胞內(nèi)具有能進(jìn)行自我復(fù)制的獨(dú)立DNA分子作為外源DNA片段的運(yùn)載體，簡稱基因載體，又稱分子克隆載體或無性繁殖載體。功能特點(diǎn)：①能自行自我復(fù)制。②容易導(dǎo)入宿主細(xì)胞。101醫(yī)學(xué)資源這種在細(xì)胞內(nèi)具有能進(jìn)行自我復(fù)制的獨(dú)立DNA分子作為外源DNA（一）基因載體的特性理想的基因載體應(yīng)具備以下特性：①要有復(fù)制子（Replicom）功能，且復(fù)制起始區(qū)中沒有限制酶的酶切位點(diǎn)。②要含有強(qiáng)啟動子，要有能促進(jìn)外源DNA高水平表達(dá)的調(diào)控區(qū)。③要有多種限制酶的單一切點(diǎn)，以適用于多種限制酶產(chǎn)生的DNA片段的插入。④具有兩種以上易被檢測的選擇性遺傳標(biāo)記，作為對重組與非重組轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記。102醫(yī)學(xué)資源（一）基因載體的特性102醫(yī)學(xué)資源⑤載體DNA的分子量要盡可能小，以利于容納較長區(qū)段的外源DNA片段。⑥應(yīng)屬于松弛型復(fù)制，能在氯霉素存在下擴(kuò)增其拷貝數(shù)。⑦從安全防治考慮，載體應(yīng)為非傳遞性，有較小的宿主范圍，不為傳遞性載體所誘導(dǎo)。103醫(yī)學(xué)資源⑤載體DNA的分子量要盡可能小，以利于容納較長區(qū)段的外源DN要達(dá)到上述要求，必須對天然存在的原始載體進(jìn)行改造并構(gòu)建成理想的載體：①引入強(qiáng)啟動子。②引入選擇性標(biāo)記基因。③切除大部分多余序列段，以提高容納外源DNA片段的能力。④引入由多種限制酶單一識別序列組成的多克隆位點(diǎn)。⑤引入多種用途的輔助序列。104醫(yī)學(xué)資源要達(dá)到上述要求，必須對天然存在的原始載體進(jìn)行改造并構(gòu)建成理想（二）常用的基因載體1、質(zhì)粒載體質(zhì)粒（Plasnid）是一些存在于微生物細(xì)胞內(nèi)染色體外的閉合環(huán)狀雙鏈的小型DNA分子，是能進(jìn)行獨(dú)立復(fù)制并保持恒定遺傳的輔助性遺傳單位，是基因工程一類主要的分子克隆載體。105醫(yī)學(xué)資源（二）常用的基因載體105醫(yī)學(xué)資源（1）pBR322

分子量2.6×106u，4.36kb。①由pMBI改造而成，引入了Tetr(抗四環(huán)素)和Ampr(抗氨芐青霉素)兩個抗藥標(biāo)記基因，去除了大部分非必須的序列，大小僅4.36kb。該質(zhì)粒有32個限制酶切位點(diǎn)，Tetr內(nèi)有BamAⅠ等10個酶切位點(diǎn)，Ampr基因內(nèi)有Pst

Ⅰ等6個限制酶切位點(diǎn)，十分有利于檢出重組轉(zhuǎn)化子。pBR322質(zhì)粒上從復(fù)制起點(diǎn)到Tetr基因間還有一個較長的非必須區(qū)域，分子量相對較大。

106醫(yī)學(xué)資源（1）pBR322106醫(yī)學(xué)資源②pAT153載體：在1644~2349位點(diǎn)之間切除了HaeⅡ片段，去除了705bp，包含接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)序列。③pBR327載體：切除了1442~2502非必須區(qū)段而成，長僅3.27kb，拷貝數(shù)增加2~4倍107醫(yī)學(xué)資源②pAT153載體：在1644~2349位點(diǎn)之間切除了Hae（2）、PUC系列載體①PUC18、PUC19質(zhì)粒載體，是2.7kb的小型載體。含有Ampr(抗氨芐青霉素)基因，復(fù)制原點(diǎn)和LacZ基因。在LacZ基因內(nèi)有多種限制酶識別位點(diǎn)組成的多克隆位點(diǎn)。在相應(yīng)的宿主（LacZ–）中可出現(xiàn)α互補(bǔ)（合成β-半乳糖苷酶）。108醫(yī)學(xué)資源（2）、PUC系列載體108醫(yī)學(xué)資源pUC質(zhì)粒載體

(1)來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(ori)；(2)氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的限制酶的單識別位點(diǎn)。(3)大腸桿菌β-半乳糖苷酶的啟動子以及編碼該酶氨基端α-肽鏈的DNA序列,此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ基因。(4)多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)段：位于lacZ基因中的靠近5’端，內(nèi)含十幾個單一的限制性內(nèi)切酶識別切割位點(diǎn)，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入載體中。109醫(yī)學(xué)資源pUC質(zhì)粒載體(1)來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(or②PUC118、PUC119分別來自PUC18、PUC19，不同的是它們均帶有M13絲狀噬菌體DNA合成的起始、終止及DNA包裝進(jìn)入噬菌體顆粒所必需的序列。110醫(yī)學(xué)資源②PUC118、PUC119110醫(yī)學(xué)資源2、λ噬菌體載體人們對λ噬菌體已進(jìn)行了長達(dá)幾十年的研究，發(fā)現(xiàn)其DNA失去占總量20%的序列時仍不失活，這部分缺失的DNA空間正好可作為運(yùn)載外源DNA之用。λ噬菌體基因組為雙鏈線狀DNA，分子量30.8×106u，具有4.85kb，含有50個基因，其中只有50%是必需的。經(jīng)改造，消除基因組必需區(qū)域中多余的限制酶切位點(diǎn)，去除λDNA中一些非必需區(qū)段。111醫(yī)學(xué)資源2、λ噬菌體載體111醫(yī)學(xué)資源①插入型載體：λDNA中缺失部分為非必需區(qū)段，只有一個可供外源DNA插入的限制酶切位點(diǎn)（單切位點(diǎn)）。②替換型載體：在λDNA可替換片段的兩端具有兩個限制酶切位點(diǎn)，酶切后的替換片段，由外源DNA片段所取代。112醫(yī)學(xué)資源①插入型載體：λDNA中缺失部分為非必需區(qū)段，只有一個可供外3、M13噬菌體載體該載體引入有LacZ基因，該基因內(nèi)有13個不同酶切位點(diǎn)組成的多克隆位點(diǎn)，可供插入多種酶切的DNA片段。可與宿主（LacZ–）形成α互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的β-半乳糖苷酶。但當(dāng)在多克隆位點(diǎn)插入外源DNA時，α互補(bǔ)消失。113醫(yī)學(xué)資源3、M13噬菌體載體113醫(yī)學(xué)資源4、粘粒（Cosmid）是一種有λ噬菌體粘性末端的雜種質(zhì)粒，由λDNA的cos區(qū)段與質(zhì)粒DNA重組構(gòu)建而成。cos序列：將DNA包裝到λ噬菌體顆粒的必需序列。粘粒是為克隆和增殖較大區(qū)段的基因組DNA而設(shè)計的，是組建真核生物基因文庫和從多種生物中分離基因的有效手段。114醫(yī)學(xué)資源4、粘粒（Cosmid）114醫(yī)學(xué)資源粘粒大小為4~7kb，常用的為5kb。噬菌體顆粒容納的最大DNA達(dá)52kb，所以粘?？煽寺〈笮?5~45kb的DNA片段。粘粒由質(zhì)粒改造而來，通常帶有1個拷貝的cosDNA序列，1個復(fù)制起點(diǎn)和1個抗藥標(biāo)記基因（Ampr）。115醫(yī)學(xué)資源粘粒大小為4~7kb，常用的為5kb。噬菌體顆粒容納的最大D5、動植物病毒用于克隆外源基因，導(dǎo)入動植物細(xì)胞為宿主細(xì)胞。116醫(yī)學(xué)資源5、動植物病毒116醫(yī)學(xué)資源作業(yè)：1、名詞解釋基因工程，限制酶，連接酶，同裂酶，限制酶星活性，基因載體，粘粒。2、基因工程技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。3、限制酶有哪些特性？4、TaqDNA聚合酶有哪些特性和用途？5、基因載體有哪些特性？6、如何將天然的原始載體改造成理想的基因載體？117醫(yī)學(xué)資源作業(yè)：117醫(yī)學(xué)資源第三節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程基因工程技術(shù)制藥的基本過程：①目的基因的制取a、從供體生物分離純化獲得含目的基因的DNA。b、供體DNA分子的酶切、目的基因的鑒別和分離。118醫(yī)學(xué)資源第三節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的基本過程基因工程技術(shù)制藥的基本過②目的基因與克隆載體的體外重組，構(gòu)建重組克隆載體。用限制性內(nèi)切酶和連接酶將目的基因拼接到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體或噬菌體載體中。③重組克隆載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)，構(gòu)建成基因工程細(xì)胞株。④含目的基因的工程細(xì)胞株的篩選、鑒定與分析。119醫(yī)學(xué)資源②目的基因與克隆載體的體外重組，構(gòu)建重組克隆載體。119醫(yī)學(xué)⑤目的基因在宿主細(xì)胞中的高效表達(dá)。包括：工程細(xì)胞株大規(guī)模培養(yǎng)最佳參數(shù)的確定，新型生物反應(yīng)器的研制與應(yīng)用，生物傳感器等一系列儀表的設(shè)計與應(yīng)用，應(yīng)用計算機(jī)對發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化控制等。⑥產(chǎn)物的分離純化高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化工藝的選擇與優(yōu)化控制以及高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)。⑦產(chǎn)品的檢驗(yàn)及安全性評價120醫(yī)學(xué)資源⑤目的基因在宿主細(xì)胞中的高效表達(dá)。120醫(yī)學(xué)資源一、目的基因的制取一種細(xì)菌DNA上有數(shù)千個基因，高等動植物有幾十萬個基因，如何從成千上萬個基因的海洋中獲得某個特定的基因。分子生物學(xué)家確定了3種主要方法，構(gòu)建基因文庫法、反轉(zhuǎn)錄法和PCR法。121醫(yī)學(xué)資源一、目的基因的制取121醫(yī)學(xué)資源（一）構(gòu)建基因文庫法分離目的基因構(gòu)建基因文庫法又稱鳥槍法或散彈射擊法：用特定的限制性內(nèi)切酶將供體DNA切成許多片段（20~24kb），即用能產(chǎn)生互補(bǔ)粘性末端的限制性內(nèi)切酶切開，可能獲得含有目的基因的DNA片段。122醫(yī)學(xué)資源（一）構(gòu)建基因文庫法分離目的基因122醫(yī)學(xué)資源1、基本概念基因文庫：將供體生物的DNA用限制酶切成許多片段，在連接酶的作用下分別與克隆載體進(jìn)行體外重組，這種含有供體生物全部不同基因的重組克隆載體的總體稱供體生物的基因文庫。123醫(yī)學(xué)資源1、基本概念123醫(yī)學(xué)資源2、基本步驟①首先從含有目的基因的供體生物的細(xì)胞或組織中提純獲得高質(zhì)量的基因組DNA。②用特定的限制性內(nèi)切酶將含有目的基因的供體基因組DNA切割成許多片段。③用能產(chǎn)生互補(bǔ)粘性末端的限制性內(nèi)切酶將載體（噬菌體或質(zhì)粒）DNA切開并去除其中的填充片段。124醫(yī)學(xué)資源2、基本步驟124醫(yī)學(xué)資源④用專一性強(qiáng)的DNA連接酶將供體DNA片段分別與載體DNA連接（供體DNA片段克隆到載體中）。⑤經(jīng)包裝繁殖而產(chǎn)生重組噬菌體克?。―NA重組體），建成供體基因組DNA文庫成員。⑥當(dāng)制備的克隆數(shù)多到足以把某種供體生物的全部基因都包含在內(nèi)時，這些克隆的總體就稱為該生物的基因文庫。125醫(yī)學(xué)資源④用專一性強(qiáng)的DNA連接酶將供體DNA片段分別與載體DNA連⑦有了基因文庫，在分離帶有目的基因的DNA重組體時就可以從文庫中篩選而不必重復(fù)地進(jìn)行全部操作。可采用放射性核酸探針雜交篩選含目的基因的重組克隆載體。若已知目的基因的核苷酸序列，可用DNA序列分析法篩選含目的基因的重組體。將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，通過工程細(xì)胞株的培養(yǎng)，檢測有無目的產(chǎn)物來篩選出含有目的基因的重組體。126醫(yī)學(xué)資源⑦有了基因文庫，在分離帶有目的基因的DNA重組體時就可以從文（二）反轉(zhuǎn)錄法（cDNA基因文庫法）1、基本原理：由于真核生物的基因大多為斷裂基因，含有非編碼間隔區(qū)（內(nèi)含子，Intron），在原核生物受體中無法正常表達(dá)，必須設(shè)法消去內(nèi)含子。mRNA是在供體生物細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)轉(zhuǎn)錄加工過的RNA，是無內(nèi)含子的遺傳密碼攜帶者。在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA（cDNA），再加上接頭，即可與載體DNA連接構(gòu)建成重組克隆載體，從而建成供體生物的cDNA基因文庫，再從中篩選帶有目的基因的DNA重組體。127醫(yī)學(xué)資源（二）反轉(zhuǎn)錄法（cDNA基因文庫法）127醫(yī)學(xué)資源cDNA基因文庫：以供體生物的總mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成核苷酸序列互補(bǔ)的DNA（cDNA），將全部cDNA分別與克隆載體進(jìn)行體外重組，這些含有供體生物全部不同基因的重組克隆載體的總體稱供體生物的cDNA基因文庫。128醫(yī)學(xué)資源cDNA基因文庫：以供體生物的總mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作2、基本步驟①從供體生物細(xì)胞或組織中提取純化得總RNA，其中含mRNA1~5%，其核苷酸序列由幾百到幾千個核苷酸組成。129醫(yī)學(xué)資源2、基本步驟129醫(yī)學(xué)資源②從總RNA中分離純化出mRNA原理：親和層析法，由于真核細(xì)胞中mRNA的3‵端常含有一多聚腺苷酸[poly(A)]組成的末端（20~250個腺苷酸），易吸附于寡聚脫氧胸苷酸[Oligo(dT)]-纖維素上。方法：含有總RNA的高鹽緩沖液流經(jīng)[Oligo(dT)]-纖維素柱時，mRNA被特異地結(jié)合在柱上。當(dāng)逐漸降低鹽的濃度洗脫時，mRNA被洗脫下來，經(jīng)過兩次[Oligo(dT)]-纖維素柱后，可得到高純度的mRNA。130醫(yī)學(xué)資源②從總RNA中分離純化出mRNA130醫(yī)學(xué)資源③cDNA的合成Ⅰ、cDNA第一鏈的合成mRNA帶有3‵-poly(A)末端，可用Oligo(dT)作為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下以mRNA為模板合成cDNA第一鏈（一般帶有發(fā)夾結(jié)構(gòu)）。一般一次可拷貝5~30%的mRNA。

mRNA5‵-GCCTACGGATCCTACGAAAAAAA-3‵cDNAATGCTTTTTTT-5‵

131醫(yī)學(xué)資源③cDNA的合成131醫(yī)學(xué)資源Ⅱ、cDNA第二鏈的合成先用堿解或RNaseH酶解除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈。然后以cDNA第一鏈為模板在DNA聚合酶Ⅰ作用下合成第二鏈（從第一鏈3‵末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)開始合成第二鏈）。再用專一性強(qiáng)的核酸酶S1切去發(fā)夾結(jié)構(gòu)，得雙鏈cDNA。雙鏈cDNA可用凝膠電泳測定其大小。132醫(yī)學(xué)資源Ⅱ、cDNA第二鏈的合成132醫(yī)學(xué)資源④cDNA的克隆——構(gòu)建DNA重組體即cDNA基因文庫的建立。經(jīng)前3步，從所獲得的mRNA分子集群對應(yīng)合成cDNA分子集群。將合成的各雙鏈cDNA分別與載體DNA進(jìn)行體外重組，構(gòu)建成cDNA重組體，即cDNA基因文庫。133醫(yī)學(xué)資源④cDNA的克隆——構(gòu)建DNA重組體133醫(yī)學(xué)資源Ⅰ、從cDNA基因文庫篩選帶有目的基因的cDNA重組體。Ⅱ、或經(jīng)包裝后轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞，得到一群含cDNA重組體的工程細(xì)胞株，再從中篩選具有目的基因的工程菌。用于cDNA體外重組的載體有噬菌體和質(zhì)粒兩類，當(dāng)cDNA片段小于10kb時用質(zhì)粒載體，大于10kb時用噬菌體載體。最好用具有操縱子的表達(dá)型載體，有利于含有目的基因的cDNA重組體篩選。134醫(yī)學(xué)資源Ⅰ、從cDNA基因文庫篩選帶有目的基因的cDNA重組體。13⑤cDNA文庫的鑒定Ⅰ、根據(jù)表達(dá)型克?。╟DNA重組體）的表型篩選a、抗性基因失活法，抑菌圈法。b、菌落或噬菌斑顏色改變法。c、α-互補(bǔ)現(xiàn)象消失法。Ⅱ、進(jìn)一步鑒定的方法有凝膠電泳、分子雜交或DNA序列測定法（在已知目的基因分子量大小和核苷酸序列條件下）。135醫(yī)學(xué)資源⑤cDNA文庫的鑒定135醫(yī)學(xué)資源⑥含目的基因cDNA重組體的篩選a、核酸探針雜交法：人工合成與目的產(chǎn)物對應(yīng)的單鏈寡聚核苷酸為探針，從cDNA文庫中篩選含目的基因的cDNA克隆。b、DNA序列分析法。c、免疫反應(yīng)鑒定法：用某目的產(chǎn)物的抗體尋找相應(yīng)的特異cDNA克隆。d、cDNA克隆的同胞選擇法：將cDNA基因文庫分成含10~100克隆的亞庫，再從各亞庫中篩選。136醫(yī)學(xué)資源⑥含目的基因cDNA重組體的篩選136醫(yī)學(xué)資源137醫(yī)學(xué)資源137醫(yī)學(xué)資源cDNA基因重組轉(zhuǎn)化核酸探針cDNA文庫138醫(yī)學(xué)資源cDNA基因重組轉(zhuǎn)化核酸探針cDNA文庫138醫(yī)學(xué)資源（三）化學(xué)合成法用化學(xué)合成法合成目的基因的DNA片段。先決條件：必須知道目的基因的核苷酸序列，或知道目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序，再推導(dǎo)出DNA的堿基序列。139醫(yī)學(xué)資源（三）化學(xué)合成法139醫(yī)學(xué)資源①先合成不同部位的雙鏈寡聚核苷酸短片段。②經(jīng)退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段。③再按正確的次序連接成較長的完整的基因DNA片段。140醫(yī)學(xué)資源①先合成不同部位的雙鏈寡聚核苷酸短片段。140醫(yī)學(xué)資源（四）RT-PCR法合成目的cDNA反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成目的基因cDNA，是近年來發(fā)展起來的一種獲取真核生物目的基因cDNA的簡便、快捷而高效的酶促合成法。該法是以目的基因的mRNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶先合成與其互補(bǔ)DNA（cDNA）的第一鏈，再進(jìn)而酶促合成雙鏈DNA。141醫(yī)學(xué)資源（四）RT-PCR法合成目的cDNA141醫(yī)學(xué)資源該法的前提是首先獲得目的基因?qū)?yīng)的mRNA。在真核生物的總RNA中rRNA占80~85%，tRNA占10~15%，mRNA占1~5%，而且mRNA種類繁多（1~3萬種），核苷酸序列各不相同，大小從數(shù)百至數(shù)千堿基不等。因此要從中分離純化目的mRNA，其難度不亞于分離目的基因。142醫(yī)學(xué)資源該法的前提是首先獲得目的基因?qū)?yīng)的mRNA。142醫(yī)學(xué)資源但人們發(fā)現(xiàn)，從某些特定型分化細(xì)胞分離的細(xì)胞質(zhì)中，編碼某特種蛋白質(zhì)的目的mRNA占總mRNA的50~90%。稱為高豐度mRNA。如網(wǎng)織紅細(xì)胞中的珠蛋白mRNA，雞輸卵管的卵清蛋白mRNA，淋巴細(xì)胞中的免疫球蛋白mRNA，眼球晶體蛋白等的mRNA均為高豐度mRNA。143醫(yī)學(xué)資源但人們發(fā)現(xiàn)，從某些特定型分化細(xì)胞分離的細(xì)胞質(zhì)中，編碼某特種蛋1、RF-PCR技術(shù)合成目的基因cDNA的一般程序①從真核生物細(xì)胞或組織中提取純化總RNA。②在Oligo(dT)為引物的引導(dǎo)下，以總RNA中的總mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成總cDNA的第一鏈。③以兩個引物所結(jié)合的單鏈目的cDNA(靶序列)為模板，大量合成雙鏈目的cDNA。144醫(yī)學(xué)資源1、RF-PCR技術(shù)合成目的基因cDNA的一般程序144醫(yī)學(xué)2、PCR技術(shù)體外擴(kuò)增DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外擴(kuò)增DNA；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerosechainreaction）技術(shù)，簡稱PCR技術(shù)，是一種用于在體外擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的分子生物學(xué)技術(shù)。應(yīng)用該技術(shù)可在很短的時間內(nèi)得到數(shù)百萬個特異DNA序列的拷貝。目前該技術(shù)已在醫(yī)學(xué)診斷、分子克隆和DNA分析中得到廣泛應(yīng)用。145醫(yī)學(xué)資源2、PCR技術(shù)體外擴(kuò)增DNA145醫(yī)學(xué)資源（1）PCR技術(shù)的基本程序①變性：首先使雙鏈DNA在反應(yīng)液中經(jīng)熱變性（94~95℃）而分開成單鏈（或使反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA:RNA雜交鏈分開成單鏈）。②退火：然后降溫至40~60℃，在低溫下與兩個引物進(jìn)行退火，使引物與單鏈DNA配對結(jié)合。③延伸：再在中溫72℃下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性和熱穩(wěn)定性進(jìn)行聚合（延伸）反應(yīng)。

146醫(yī)學(xué)資源（1）PCR技術(shù)的基本程序146醫(yī)學(xué)資源

變性94~95℃

退火40~60℃延伸72℃147醫(yī)學(xué)資源147醫(yī)學(xué)資源PCR擴(kuò)增原理引物延伸延伸5’5’3’3’變性、退火變性、退火148醫(yī)學(xué)資源PCR擴(kuò)增原理引物延伸延伸5’5’3