淀粉樣多肽誘導(dǎo)阿爾茲海默癥的研究進(jìn)展

淀粉樣多肽誘導(dǎo)阿爾茲海默癥的研究進(jìn)展

阿爾茨海默綜合征（ad）是最常見的老年人疾病，于1906年首次報告。其臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能退化,記憶力和學(xué)習(xí)能力降低,最終喪失自主生活能力。隨著我國人口老齡化程度的加劇,阿爾茲海默癥已經(jīng)成為了我國國民重要的健康隱患。目前對于阿爾茲海默癥尚無有效的早期診斷手段和治療方法,已發(fā)現(xiàn)的病理特征為神經(jīng)元內(nèi)部的神經(jīng)纏結(jié)和細(xì)胞外的淀粉樣斑塊。神經(jīng)纖維纏結(jié)是由一種微管結(jié)合蛋白(tau蛋白)因過磷酸化從微管上脫離并且自聚集成為纖維狀蛋白所導(dǎo)致的。此聚集容易造成神經(jīng)元細(xì)胞骨架崩解,進(jìn)而引發(fā)神經(jīng)炎癥,同時聚集的纖維在細(xì)胞內(nèi)堆積會造成神經(jīng)信號通路的敏感性降低。淀粉樣斑塊是由β淀粉樣多肽(amyloid-β,Aβ)在大腦的海馬區(qū)及皮層發(fā)生沉積(聚集)造成的,Aβ是一段長度為40多個氨基酸的多肽,由其前體——淀粉樣蛋白前體(amyloidprecusorprotein,APP)水解得到。APP是一個一次跨膜蛋白,其N端暴露在細(xì)胞外,在β分泌酶(β-secretase,又稱betasiteAPPcleavingenzyme,BACE1)和γ分泌酶(γ-secretase)的共同切割下可以得到完整的Aβ蛋白,如圖1所示。由于切割位點(diǎn)的多樣性,得到的蛋白會含有不同數(shù)量的氨基酸殘基,在人體內(nèi)含量較多的Aβ形式是含有40個氨基酸的Aβ1-40(Aβ40)和含有42個氨基酸的Aβ1-42(Aβ42)。目前的研究進(jìn)展表明,Aβ蛋白的聚集在阿爾茲海默癥的發(fā)病過程中有著重要的作用,是最重要的致病因素之一;而且,在神經(jīng)系統(tǒng)中有著關(guān)鍵生理作用的朊蛋白在Aβ誘發(fā)阿爾茲海默癥的過程中有著重要的調(diào)控作用;因此,筆者旨在討論朊蛋白在阿爾茲海默癥的發(fā)病過程中所起到的復(fù)雜作用,同時對多種復(fù)雜關(guān)系進(jìn)行分析,對以朊蛋白為靶點(diǎn)的治療手段進(jìn)行了預(yù)測。1由于a'的遺傳過程和氨基酸磷的生理功能1.1對細(xì)胞毒性和神經(jīng)系統(tǒng)退行如圖2所示,在Aβ的聚集過程中,通常會經(jīng)過2種狀態(tài),首先形成球狀的可溶性寡聚體,寡聚體再進(jìn)一步形成纖維絲狀結(jié)構(gòu)沉淀在細(xì)胞膜表面。從單體到寡聚體再到纖維絲要經(jīng)歷不同的構(gòu)象,通常Aβ蛋白形成纖維絲時會呈現(xiàn)出大量的反向平行的β折疊結(jié)構(gòu),此結(jié)構(gòu)對于細(xì)胞膜會有傷害并引發(fā)細(xì)胞凋亡。然而,有研究表明,在Aβ聚集的過程之中,寡聚體往往具有更大的毒性。實驗證明將寡聚體注射到小鼠腦內(nèi)會造成小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力降低,大量細(xì)胞實驗也證明寡聚體對于細(xì)胞具有更大的毒性,甚至有研究表明tau蛋白的過磷酸化也可能是由于Aβ寡聚體造成的。目前,普遍認(rèn)為Aβ寡聚體通過兩種方式造成細(xì)胞毒性和神經(jīng)系統(tǒng)退行:一方面是Aβ寡聚體能夠附著于細(xì)胞膜上從而改變細(xì)胞膜通透性。有實驗表明,Aβ蛋白形成的寡聚體在膜環(huán)境下,往往傾向于形成α螺旋的構(gòu)象,這一構(gòu)象容易插入磷脂膜內(nèi)形成跨膜蛋白。計算研究發(fā)現(xiàn)多個這樣的跨膜單位能夠組成跨膜通道,進(jìn)而使得膜內(nèi)外的水分子和離子的通透性大大增加,最終由于滲透壓的改變導(dǎo)致細(xì)胞膜的崩解和神經(jīng)元的凋亡。在體外的模擬實驗中,也觀察到Aβ蛋白能夠改變磷脂脂質(zhì)體的離子通透性。另一方面,Aβ寡聚體能夠與受體結(jié)合,介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞炎癥的相關(guān)通路。即Aβ蛋白寡聚體不直接與磷脂膜作用時,而是作為信號分子或信號分子的抑制劑與細(xì)胞膜表面的Aβ受體結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)異常通路的激活或者正常通路的抑制[30。由于生物信號具有很大的擴(kuò)增作用,在發(fā)病過程中這種效應(yīng)往往能夠發(fā)生更大的效用。在目前的研究中,被發(fā)現(xiàn)的受體分子有胰島素受體等。不同的受體會有不同的功能,其中朊蛋白是較為特殊的一種受體。1.2蛋白基因?qū)ι窠?jīng)的影響朊蛋白是動物體內(nèi)一種高度保守的蛋白,在神經(jīng)系統(tǒng)中有較高的表達(dá)。成熟的朊蛋白包含209個氨基酸殘基并有較為復(fù)雜的糖基化修飾,它的C端通過糖基磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞膜的脂筏上,并暴露在細(xì)胞膜外側(cè)。游離的朊蛋白容易與糖基化磷脂酰肌醇結(jié)合并定位在脂筏上。在其N端有若干個八肽重復(fù)序列,據(jù)報道和銅離子有較好的結(jié)合能力。雖然錯誤折疊的朊蛋白會引發(fā)瘋牛病、羊搔癢癥等很多傳染性神經(jīng)退行疾病,但是正常的朊蛋白(也稱細(xì)胞型朊蛋白,cellularprionprotein,prpc)在神經(jīng)系統(tǒng)中有著較為重要的功能。目前發(fā)現(xiàn)敲除了朊蛋白基因核心區(qū)段的小鼠在低齡期已發(fā)生神經(jīng)退行,而敲除不同區(qū)段的朊蛋白基因會對神經(jīng)系統(tǒng)有不同的影響,說明其對于神經(jīng)發(fā)育有著較為重要而復(fù)雜的作用。同時,朊蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中還有調(diào)節(jié)細(xì)胞膜內(nèi)外氧化壓力以及離子平衡的作用,是神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)量較高而且較為重要的一種蛋白。2信號分子受體目前對于朊蛋白在阿爾茲海默癥的發(fā)病過程中的影響主要有兩種觀點(diǎn):其一認(rèn)為朊蛋白作為膜錨定蛋白能夠起到信號分子受體的作用,通過與細(xì)胞外的Aβ寡聚體結(jié)合引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的通路而產(chǎn)生毒性;另一觀點(diǎn)認(rèn)為朊蛋白能夠影響Aβ的生成從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。實際上,由于朊蛋白本身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及糖基化修飾的復(fù)雜性導(dǎo)致了其本身具有多種功能,此二種功能可能在體內(nèi)同時存在并且均發(fā)揮一定的作用。2.1蛋白化合物引起的神經(jīng)毒性2.1.1誘導(dǎo)細(xì)胞毒性Lauren等在2009年的報道稱,敲除了朊蛋白基因的細(xì)胞系對于Aβ寡聚體介導(dǎo)的神經(jīng)毒性不敏感。Bate等發(fā)現(xiàn)向敲除朊蛋白基因的細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入游離的朊蛋白時,Aβ寡聚體對細(xì)胞的毒性會隨著加入的朊蛋白量的增加而逐漸恢復(fù)敏感性,說明很有可能Aβ蛋白寡聚體誘發(fā)細(xì)胞毒性的過程中需要朊蛋白介導(dǎo)。且AlunWilliams課題組還發(fā)現(xiàn),朊蛋白的表達(dá)量并沒有影響Aβ蛋白的聚集程度。后來陸續(xù)發(fā)現(xiàn),朊蛋白能夠介導(dǎo)Aβ引起多種生理反應(yīng),包括電位失常、突觸損傷、跨膜物質(zhì)運(yùn)輸效率降低甚至細(xì)胞凋亡等。在體外利用Aβ蛋白寡聚體和朊蛋白的實驗證據(jù)表明,Aβ蛋白寡聚體和細(xì)胞膜上的朊蛋白能夠直接結(jié)合,而此結(jié)合是細(xì)胞毒性產(chǎn)生的原因。Lauren、Freir等利用朊蛋白的單克隆抗體與兩種蛋白的結(jié)合位點(diǎn)相互作用而阻斷朊蛋白和Aβ寡聚體的結(jié)合,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)毒性也隨之消失。Freir等還在體外利用免疫學(xué)實驗證明二者之間的結(jié)合具有特異性,而且結(jié)合位點(diǎn)位于朊蛋白的91~119位氨基酸之間。Lauren也發(fā)現(xiàn)95~110位氨基酸是朊蛋白和Aβ42蛋白的結(jié)合位點(diǎn),敲除這些位點(diǎn)或者利用單克隆抗體與這一位點(diǎn)結(jié)合后,細(xì)胞對于Aβ寡聚體所誘導(dǎo)的毒性再次顯示出不敏感性。Bate和Freir等通過實驗和計算中發(fā)現(xiàn),朊蛋白往往以2︰1甚至更高的比例和Aβ蛋白寡聚體相結(jié)合,與多個朊蛋白結(jié)合使得Aβ寡聚體與細(xì)胞膜表面的朊蛋白集合更牢固。而且有報道表明,Aβ蛋白寡聚體能夠使得細(xì)胞膜表面的朊蛋白增加并富集在Aβ寡聚體周圍。因此,由于朊蛋白暴露在細(xì)胞膜外,Aβ蛋白寡聚體可能通過與朊蛋白結(jié)合導(dǎo)致其引發(fā)細(xì)胞膜內(nèi)的代謝異常;同時,由于朊蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的生理功能,Aβ寡聚體與大量的朊蛋白結(jié)合后會造成朊蛋白正常的功能紊亂;因此可以推測朊蛋白在Aβ寡聚體誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的過程中有著重要的作用。2.1.2蛋白誘導(dǎo)a寡聚體的細(xì)胞磷脂酶激活和激活在研究朊蛋白介導(dǎo)的Aβ蛋白寡聚體誘發(fā)神經(jīng)毒性的過程中,可以通過對細(xì)胞內(nèi)各種功能物質(zhì)和反應(yīng)的變化來確定朊蛋白受體引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。2009年Bate等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中突觸泡蛋白的量會隨著外源朊蛋白加入量的增加而減少,而細(xì)胞內(nèi)被激活的細(xì)胞磷脂酶(cellularphosphalipaseA2,cPLA2)會隨之增加。由于突觸泡蛋白是跨膜蛋白,細(xì)胞膜的損傷會造成膜蛋白脫落,因而細(xì)胞膜的損傷顯然是由于細(xì)胞磷脂酶的激活引起的。細(xì)胞磷脂酶被激活之后,能夠使得細(xì)胞膜崩解、突觸退化、運(yùn)輸能力降低以及突觸膜蛋白脫落等一系列神經(jīng)損傷。因此,根據(jù)AlunWilliams小組的工作,朊蛋白介導(dǎo)Aβ蛋白誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的機(jī)理很可能是其激活了細(xì)胞磷脂酶。雖然朊蛋白不是跨膜蛋白,但是其依然能夠傳遞生物信號,這很可能是因為朊蛋白錨定在細(xì)胞膜的脂筏區(qū),而脂筏是細(xì)胞膜功能特異性的區(qū)域,在此區(qū)域朊蛋白和Aβ蛋白寡聚體的結(jié)合或許會影響細(xì)胞正常的生理代謝功能。Bate等在離心細(xì)胞裂解物時發(fā)現(xiàn)激活的細(xì)胞磷脂酶主要出現(xiàn)在脂筏所存在的組分中,說明細(xì)胞磷脂酶轉(zhuǎn)移到了脂筏上并且很可能定位到朊蛋白附近;而從細(xì)胞裂解物中分離出脂筏后,利用免疫化學(xué)方法能夠確定該組分中有Aβ蛋白寡聚體、朊蛋白和細(xì)胞磷脂酶的共同存在。這說明在Aβ蛋白寡聚體與朊蛋白相結(jié)合的時候,會使激活的細(xì)胞磷脂酶轉(zhuǎn)移到脂筏上,而此時激活的細(xì)胞磷脂酶在細(xì)胞膜附近時會對其造成傷害。但如果在細(xì)胞裂解物中加入能使脂筏崩解的表面活性劑,則離心之后無法得到3種蛋白的共聚物,說明了這三者并非直接作用,而是依賴于脂筏這一復(fù)雜的多功能結(jié)構(gòu)相結(jié)合。Bate還通過分析朊蛋白和Aβ寡聚體的復(fù)合物發(fā)現(xiàn),在此誘導(dǎo)毒性的過程中,Aβ蛋白的寡聚體與朊蛋白以1︰2的比例結(jié)合,若使用有兩個朊蛋白表位單克隆抗體與細(xì)胞直接作用時,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性和細(xì)胞磷脂酶的激活與Aβ寡聚體的作用結(jié)果相同。這說明Aβ寡聚體很可能并不是必需的,而只需要兩個朊蛋白分子互相靠近即可。因此推測朊蛋白介導(dǎo)Aβ寡聚體的細(xì)胞毒性的作用機(jī)理有可能是Aβ寡聚體其導(dǎo)致細(xì)胞膜表面的朊蛋白的二聚化或相互靠近所導(dǎo)致的,如圖3所示。因此,朊蛋白介導(dǎo)Aβ寡聚體毒性的關(guān)鍵是二者在脂筏區(qū)的結(jié)合以及隨后誘導(dǎo)的細(xì)胞磷脂酶的激活和定位。Bate等利用抑制劑抑制細(xì)胞磷脂酶的作用后,發(fā)現(xiàn)朊蛋白介導(dǎo)Aβ寡聚體誘發(fā)神經(jīng)毒性的能力也消失了。結(jié)合Lauren和Freir等利用單克隆抗體的方法,可知朊蛋白和Aβ寡聚體的結(jié)合以及細(xì)胞磷脂酶的激活是AD發(fā)病過程中的重要步驟,同時也應(yīng)是治療AD的重要靶點(diǎn)。2.2蛋白的表達(dá)程度雖然大量的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)朊蛋白是Aβ產(chǎn)生毒性的重要因素,但是同樣有報道發(fā)現(xiàn)朊蛋白的表達(dá)程度的增加,Aβ蛋白的產(chǎn)生量會有所降低,即朊蛋白能夠減少Aβ的產(chǎn)生,從而有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。2.2.1蛋白表達(dá)程度的影響由于朊蛋白在自身序列、糖基修飾以及生理功能上都有一定的復(fù)雜性和特殊性,因此其在神經(jīng)退行性疾病中的作用也較為復(fù)雜。在不同實驗條件下,有時也會發(fā)現(xiàn)朊蛋白不具有介導(dǎo)Aβ蛋白寡聚體毒性的功能,甚至在阿爾茲海默癥的發(fā)病過程中有一定的神經(jīng)保護(hù)功能。Parkin等利用朊蛋白表達(dá)程度不同的細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn),隨著朊蛋白的表達(dá)程度的增加,細(xì)胞所產(chǎn)生的Aβ蛋白的量會有所減少,當(dāng)干擾朊蛋白的表達(dá)后,Aβ蛋白的生成又會增加。由于發(fā)現(xiàn)APP蛋白的表達(dá)量并沒有減少,而由β分泌酶單獨(dú)切割A(yù)PP蛋白所產(chǎn)生的sAPPβ的量也會減少,可以推測知道朊蛋白具有抑制β分泌酶的作用效果。2.2.2蛋白c端與糖基化為蛋白的運(yùn)輸目Parkin等利用人工重組質(zhì)粒的方法分析了在這一保護(hù)作用中起作用的朊蛋白片段,他在朊蛋白基因上的不同區(qū)段進(jìn)行突變后,分析了突變體對于細(xì)胞分泌Aβ的影響,最終發(fā)現(xiàn)朊蛋白完整的N端和C端是起到這一保護(hù)作用的關(guān)鍵,如果此二片段被敲除或替換,則朊蛋白不再能夠減少Aβ的分泌。正常的朊蛋白C端上有和糖基化磷脂酰肌醇的連接位點(diǎn)。如果將C端與糖基化磷脂酰肌醇結(jié)合的位點(diǎn)突變成跨膜單位時,即使朊蛋白能夠固定在細(xì)胞膜上,也無法行使神經(jīng)保護(hù)作用,這說明朊蛋白的保護(hù)作用的發(fā)揮依賴于其定位于脂筏上。而正常朊蛋白的N段具有復(fù)雜的糖基化修飾,若用肝素將N端糖基上的活性位點(diǎn)占據(jù)或者敲掉N端糖基化的肽段,其也無法行使神經(jīng)保護(hù)作用。因此可以推測,朊蛋白上N端修飾的氨基葡聚糖很可能是發(fā)揮作用的活性位點(diǎn)。為了進(jìn)一步研究朊蛋白對于β分泌酶的抑制機(jī)理,Hooper課題組在表達(dá)朊蛋白的細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入β分泌酶,利用朊蛋白抗體進(jìn)行免疫共沉淀實驗,發(fā)現(xiàn)朊蛋白能夠特異性結(jié)合β分泌酶,而此結(jié)合又能夠被肝素可逆地阻斷。由此可知β分泌酶與朊蛋白N段的糖基有很好的結(jié)合作用。由于朊蛋白在細(xì)胞膜表面的分布局限于脂筏上,因此在與朊蛋白上的糖基相結(jié)合之后,β分泌酶行使切割作用范圍在空間上就大大縮小了。最終Aβ蛋白的分泌量降低,對神經(jīng)元的損傷也就降低了。2.2.3蛋白的保護(hù)作用目前對于朊蛋白在阿爾茲海默癥中的兩種作用均已被證明存在。實際上,由于朊蛋白的結(jié)構(gòu)和后修飾的復(fù)雜性,其生理功能具有多重性和復(fù)雜性也不難理解。深入分析以上兩種不同影響的機(jī)理可以發(fā)現(xiàn),朊蛋白的有害作用主要是100位氨基酸附近的氨基酸殘基發(fā)揮的作用,該位點(diǎn)和Aβ蛋白寡聚體的直接結(jié)合導(dǎo)致了朊蛋白的分布變化從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞磷脂酶的激活;而其保護(hù)作用主要是通過朊蛋白上修飾的糖基完成,糖基和β-分泌酶的結(jié)合導(dǎo)致了對后者作用的抑制。即朊蛋白的不同區(qū)域發(fā)揮著不同的生理功能。由于Williams課題組控制朊蛋白的量的方式是向敲除了朊蛋白基因的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入游離的朊蛋白,雖然朊蛋白能夠自發(fā)地與糖基化磷脂酰肌醇結(jié)合并被后者錨定在脂筏上,但是缺乏正常的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)修飾,某些糖基上的位點(diǎn)的作用可能沒有被發(fā)現(xiàn),可能因此只發(fā)現(xiàn)了朊蛋白的毒性作用。在其他的實驗中,Lauren等通過轉(zhuǎn)染的方式控制朊蛋白的表達(dá),依然發(fā)現(xiàn)了完整修飾的朊蛋白有介導(dǎo)細(xì)胞毒性的作用,而Parkin也只發(fā)現(xiàn)了朊蛋白能夠?qū)е翧β蛋白的減少,并沒有發(fā)現(xiàn)此作用可以降低細(xì)胞毒性,由此推測,這兩種作用中,朊蛋白的介導(dǎo)細(xì)胞毒性的作用占主導(dǎo)。實際上,Aβ和朊蛋白能夠相互調(diào)控,APP被切割分泌后的殘基(AICD)能夠加強(qiáng)朊蛋白的表達(dá),而朊蛋白反饋減弱APP的切割,這種調(diào)節(jié)使得