利用4dna連接酶構(gòu)建枝霉as3二十三6的pcr體系

利用4dna連接酶構(gòu)建枝霉as3二十三6的pcr體系

例如，高脂肪脂肪酸（h），如花生四烯酸（20:4-n6）和十二碳六烯酸（sd），不僅具有多種生理功能，而且還具有促進腦發(fā)育、心血管功能、炎癥反應(yīng)反應(yīng)等的功能。此外，它也是生物膜磷脂的重要組成部分，用于細胞內(nèi)的信號傳達和基因的表達、細胞分化和調(diào)節(jié)脂代謝。Δ6_脂肪酸脫氫酶作用于生物體合成高不飽和脂肪酸的第一步催化反應(yīng)將亞油酸轉(zhuǎn)化為亞麻酸,是高不飽和脂肪酸合成過程的限速酶,因此受到多個水平的調(diào)節(jié),雖然目前已從多種生物體內(nèi)克隆到Δ6_脂肪酸脫氫酶基因序列,但對絲狀真菌來源的啟動子序列的克隆分析尚未見報道,所以其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)有待于深入研究。在這一背景下,本研究室以雅致枝霉(Thamnidiumelegans)As3.2806為研究對象,在克隆了其Δ6_脂肪酸脫氫酶基因序列(GenBank注冊號:DQ099380)的基礎(chǔ)上,利用長引物嵌套式反向PCR方法克隆該基因上游1.3kb的序列,通過分析具有多個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件(GenBank注冊號:DQ309425),是首次報道Δ6_脂肪酸脫氫酶基因上游序列,通過實驗證明該方法是克隆絲狀真菌已知基因上游序列簡單有效的方法。1材料和方法1.1材料表面1.1.1ans菌體雅致枝霉(Thamnidiumelegans)As3.2806,購自中國科學院微生物研究所。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α,本研究室保存。1.1.2資產(chǎn)組合公司資產(chǎn)組合pGEM_Tvector,購自Promega公司;雅致枝霉As3.2806Δ6_脂肪酸脫氫酶基因,本研究室克隆,GenBank號:DQ099380。1.1.3po3g,mgso47h2o(1)土豆培養(yǎng)基(1L):土豆200g,葡萄糖20g,KH2PO43g,MgSO4·7H2O1.5g,瓊脂12g,pH自然;(2)LB培養(yǎng)基(1L):蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl5g,用NaOH調(diào)pH至7.4,固體培養(yǎng)基補加15g瓊脂。1.1.4t載體連接試劑盒各種限制酶及T4DNA連接酶購自大連寶生物工程公司;PCR用2×MasterMix、植物基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、核酸分子量標準(Marker)購自北京天為時代有限公司;T_載體連接試劑盒購自Promega公司;寡核苷酸引物由北京奧科生物公司合成;其余有機試劑和藥品均為國產(chǎn)分析純。1.2方法1.2.1提取的組系統(tǒng)調(diào)整按植物基因組提取試劑盒說明書進行。1.2.2選擇性內(nèi)切酶的制備分別用EcoRⅠ、KpnⅠ對基因組DNA進行消化,反應(yīng)體系如下:基因組DNA15μL(30ng/μL),10×Buffer5μL,相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶1μL(10～15u/μL),加水補至50μL,在37℃反應(yīng)2h,65℃水浴15min滅活限制性內(nèi)切酶。1.2.3pcr反應(yīng)體系及產(chǎn)物回收取酶切產(chǎn)物6μL(9ng/μL),加10×LigaseBuffer2μL,T4連接酶1μL(350u/μL),加水補至20μL,4℃反應(yīng)過夜。PCR反應(yīng)體系:2×MasterMix12.5μL,上下游引物(20μmol/L)各1μL,模板DNA(連接產(chǎn)物或上一輪PCR產(chǎn)物)1μL,加水補至25μL。PCR產(chǎn)物回收連接至pGEM_T載體,E.coliDH5α感受態(tài)細胞的制備、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選、質(zhì)粒提取等見參考文獻。引物合成于北京奧科公司(見表1),測序由北京三博公司完成。2結(jié)果2.1不同擴增期從gemt轉(zhuǎn)化為gema及脂肪酸脫氫酶基因序列利用第一輪長引物兩步法反向PCR,及隨后兩輪嵌套式落降PCR(見圖1),擴增出4.0kb左右的片段(圖2),將其回收連接于pGEM_T,轉(zhuǎn)化DH5α,測序結(jié)果表明克隆得到長3.8kb序列,與已克隆雅致枝霉Δ6_脂肪酸脫氫酶基因序列(GenBank號:DQ099380)比對,分別在雅致枝霉Δ6_脂肪酸脫氫酶基因5′端上游延伸1.3kb與該基因5′端有132bp重疊(見圖3),在3′端下游延伸2.5kb,與基因3′端有122bp重疊(見圖4),并具有SacⅠ酶切位點,與質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果一致。2.2dna的pcr擴增為驗證克隆的正確性從得到的5′上游序列兩端設(shè)計引物P7和P8,分別以帶有3.8kb擴增片段的質(zhì)粒、基因組DNA和EcoRⅠ消化后的基因組DNA為模板進行擴增,反應(yīng)條件:94℃3min;94℃30s,45℃1min,72℃2min,5cycles;94℃30s,58℃1min,72℃2min,25cycles;72℃10min。結(jié)果如圖5所示,在三個模板中均擴增得到1.3kb的特異性片段,與預期片段大小相符。2.3在組織胞漿菌中的轉(zhuǎn)錄因子對雅致枝霉Δ6_脂肪酸脫氫酶基因上游1318bp序列分析顯示該序列中含有5個TATAbox,和多個脂肪酸脫氫酶轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(見圖6)。其中CCAATcis_elemen和AP_1是存在于硬脂酰脫氫酶Scd1等多個脂肪酸基因轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控元件,而且發(fā)現(xiàn)存在于在絲狀真菌夾膜組織胞漿菌(HistoplasmacapsulatumDownsATCC38904)Δ9_脂肪酸脫氫酶基因啟動子中AP_1元件(保守序列TGACTAA),對溫度敏感型菌株受溫度影響發(fā)生兩型性生長具有重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。FSE_2(fat_specifcelement_2)是存在于人類SCD和小鼠Scd1、Scd2啟動子中的保守序列,STRE(Stress_responsiveelement)同樣存在于魯氏毛霉(Mucorrouxii)Δ9_脂肪酸脫氫酶基因啟動子序列中,CCAATcis_element在真核生物啟動子中普遍存在,是真核生物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點,并已發(fā)現(xiàn)的在人類肝細胞硬脂酰脫氫酶基因上有保守的順式調(diào)控元件,這些結(jié)合位點的存在意味著該序列是一個潛在的真核生物啟動子,受到各種轉(zhuǎn)錄激活因子、阻遏蛋白、增強因子的調(diào)控。據(jù)此推測該序列為一在脂肪酸代謝中具有重要作用的啟動子調(diào)控序列。3pcr法目前擴增鄰近未知序列的方法有文庫篩選法、熱不對稱交錯PCR(TAILPCR)法、接頭連接PCR(Adaptor_ligationPCR)法、反向PCR(inversePCR)法等。反向PCR(inversePCR)最早由Ochman開發(fā),是將復雜的模板DNA(如基因組DNA、YAC克隆DNA等)用單一限制性內(nèi)切酶或產(chǎn)生可互補粘性末端的兩種限制性內(nèi)切酶進行消化,然后在低濃度條件下進行連接反應(yīng),使其自身環(huán)化并以此為模板,從已知序列向未知序列方向設(shè)計引物,擴增已知序列的相鄰序列的方法。3.1物基因組提取試驗完整的基因組DNA是反向PCR成功的關(guān)鍵,選用植物基因組提取試劑盒利用硅質(zhì)材料對DNA進行特異性吸附,最大限度的減小液體對DNA的剪切,保證基因組的完整,得到高質(zhì)量的絲狀真菌基因組DNA(圖7)。3.2接反應(yīng)帶來的困難限制酶必需選用在已知序列中不存在酶切位點的酶,并應(yīng)盡量選擇酶切效率高、特異性好、能產(chǎn)生粘性末端且常用的酶,選擇產(chǎn)生平末端的酶則給連接反應(yīng)帶來額外的困難。識別6bp序列的限制酶,在基因組平均中每隔46=4096bp,與預期所克隆的序列長度匹配,此外考慮到基因組的甲基化等問題,在本實驗中選用EcoRⅠ、KpnⅠ對基因組DNA進行消化,結(jié)果EcoRⅠ消化基因組DNA得到了很好的結(jié)果。另外,可以對樣品DNA同時選用幾種限制性內(nèi)切酶分別進行消化,分別進行PCR擴增,擇優(yōu)選用,提高了實驗的效率,同時提供平行對照,增加實驗的準確性。3.3pcr擴增效果長的線狀DNA在低濃度下有利于自身環(huán)化連接,但具體濃度隨DNA復雜程度和所選用的內(nèi)切酶的不同而不同,在一些報道中連接反應(yīng)的DNA的濃度一般在納克級,但在此后的PCR反應(yīng)中要加入相對多量的模板。在本研究中同時選用了1ng/μL、2ng/μL、3ng/μL、4ng/μL等幾個連接濃度梯度,其中在濃度為3ng/μL的連接產(chǎn)物中獲得了較好的擴增結(jié)果。由于真菌的基因組(108數(shù)量級)較典型的哺乳動物基因組(1010數(shù)量級)要小,因此在PCR擴增時只取1μL作為模板便可有效擴增,在預實驗中加大模板量并沒有改善擴增結(jié)果(結(jié)果未顯示)。3.4pcr擴增序列在基因組酶切環(huán)化的體系中同時存在多個異質(zhì)性的模板,嚴重影響PCR擴增的準確性,為此設(shè)計了一對長35nt,Tm值為78℃的引物,并采取68℃一步退火_延伸的方法,提高了產(chǎn)物的特異性。通過這一輪PCR,已經(jīng)可以在一片smear中找到一條特異的電泳條帶(圖3,通道3),這一步也是克隆策略中的關(guān)鍵一步。由于目標產(chǎn)物片段較長且存在許多未知因素,采用了三輪嵌套式PCR反應(yīng),在第二和三輪選擇了降落PCR(touch_downPCR)方法。利用上述不同的PCR技術(shù)的有機組合,成功擴增出已知基因的旁側(cè)序列,其中5′上游1.3kb,