真菌6-脂肪酸脫氫酶基因459bp的克隆及異源表達(dá)

真菌6-脂肪酸脫氫酶基因459bp的克隆及異源表達(dá)

作為人體的必要脂肪酸，它被認(rèn)為是重要的生理活性物質(zhì)的前列腺素pg-i和pg-ii的前體，在調(diào)節(jié)人體激素和脂肪酸代謝方面發(fā)揮著重要作用。γ-亞麻酸是通過Δ6-脂肪酸脫氫酶將亞油酸的第六位碳原子脫氫轉(zhuǎn)化形成的,因此,Δ6-脂肪酸脫氫酶是γ-亞麻酸生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶,并成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。自九十年代初期由美國(guó)的Reddy等人首次報(bào)道了產(chǎn)生γ-亞麻酸的單細(xì)胞蘭細(xì)菌(Synechocystissp.)PCC6803分離出Δ6-脂肪酸脫氫酶基因,并在另一株不產(chǎn)生γ-亞麻酸的蘭細(xì)菌(Anabaenasp.)中成功表達(dá)以來(lái),先后從植物琉璃苣,絲狀真菌高山被孢霉,線蟲等克隆到了該基因,并在釀酒酵母和煙草中進(jìn)行了表達(dá)。2000年,Sperling等報(bào)道從苔蘚(Ceratodonpurpureus)中克隆到具有雙重功能的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因,不僅可以在亞油酸C6上脫氫形成亞麻酸,而且可以在該位置上繼續(xù)脫氫,形成一個(gè)炔鍵。2003年Y.Michinaka報(bào)道了在卷枝毛霉中克隆到兩個(gè)Δ6-脂肪酸脫氫酶同工酶基因,而且在低溫下表達(dá)量存在明顯差異。雅致枝霉是一種可以在低溫條件下生長(zhǎng)的毛霉目低等絲狀真菌,Manocha等報(bào)道在低溫誘導(dǎo)下雅致枝霉不僅產(chǎn)生γ-亞麻酸還可產(chǎn)生α-亞麻酸,這在低等絲狀真菌是首次發(fā)現(xiàn),因此克隆和分析雅致枝霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因,對(duì)研究低溫誘導(dǎo)不飽和脂肪酸合成的調(diào)節(jié)具有重要的意義。本文采用RT-PCR及RACE方法得到一段1504bp的全長(zhǎng)cDNA序列。對(duì)長(zhǎng)度為1377bp的開放閱讀框架進(jìn)行了功能性表達(dá)。這是國(guó)際上首次從雅致枝霉克隆到Δ6-脂肪酸脫氫酶基因并在釀酒酵母中進(jìn)行功能性驗(yàn)證的報(bào)道。1材料和方法1.1材料表面1.1.1質(zhì)粒載體pgem-t雅致枝霉(ThamnidiumelegansAs3.2806)、購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所;大腸桿菌(EscherichiacoliDH5α)由本實(shí)驗(yàn)室保藏;質(zhì)粒載體pGEM-T購(gòu)自Promega公司;釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeINVSc1)營(yíng)養(yǎng)缺陷型及表達(dá)載體pYES2.0購(gòu)自Invitrogen公司。1.1.2聚合酶、內(nèi)酰胺酶及聚合酶所有DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司,X-Gal、IPTG、TaqDNA聚合酶購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司,氨芐青霉素、NP-40及亞油酸購(gòu)自Sangon公司,脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒和pGEM-T載體為Promega公司產(chǎn)品,SMRTTMRACEcDNAAmplificationKit為Clontech公司產(chǎn)品。氣相色譜儀為島津GC-7A。1.1.3培養(yǎng)樹霉pda培養(yǎng)基大腸桿菌LB培養(yǎng)基,見文獻(xiàn),雅致枝霉PDA培養(yǎng)基,見文獻(xiàn)酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型按Invitrogen公司操作手冊(cè)進(jìn)行,誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)基按文獻(xiàn)。1.1.4引用的合成和測(cè)量順序引物合成由北京奧科公司完成,引物序列及用途(表1)。測(cè)序均由上海生工完成。1.2-amv-cl2的合成按上海生工的UNIQ-10TRIzol總RNA提取試劑盒方法,從液體培養(yǎng)36h的雅致枝霉中抽濾獲得菌絲體然后液氮研磨提取總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求,取1μg總RNA為模板,Oligo(dT)15為反轉(zhuǎn)錄引物,70℃變性10min,冰浴5min,然后分別加入,5μL10×RTbuffer,2μLMgCl2(25mmol/L),0.5μLasinRNain(40U/μL),0.5μLAMV(20U/μL),加水補(bǔ)至20μL,42℃反應(yīng)1h,95℃加熱10min終止反應(yīng),合成第一條cDNA,-20℃?zhèn)溆?。根?jù)已報(bào)道深黃被孢霉(Mortierellaalpina),卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、少根根霉(Rhizopusarrhizus)的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因同源序列組氨酸保守區(qū)HisII(WWKNKHNTHH)和另一氨基酸保守區(qū)的氨基酸序列(HNGMPV)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物P1和P2,取2μLcDNA進(jìn)行PCR。擴(kuò)增條件:94℃變性3min;94℃1min,37℃2min,72℃1min,5個(gè)循環(huán);94℃1min,57℃2min,72℃1.5min,30個(gè)循環(huán);72℃10min。將PCR產(chǎn)物回收并克隆到pGEM-T載體上,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,藍(lán)白斑篩選和酶切鑒定陽(yáng)性克隆,挑選正確的陽(yáng)性克隆測(cè)序。1.3整個(gè)hda的擴(kuò)展1.3.1生物基因型pcr檢測(cè)以P5作為反轉(zhuǎn)錄引物,按上述方法反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA。根據(jù)已獲得的部分cDNA序列設(shè)計(jì)基因特異性引物P3與3′RACE下游引物P4進(jìn)行3′cDNA末端擴(kuò)增,條件94℃變性3min;94℃1min,57℃1min,72℃1min,30個(gè)循環(huán),72℃10min。將PCR產(chǎn)物回收并克隆到pGEM-T載體上,挑選正確的陽(yáng)性克隆測(cè)序。1.3.2合成相關(guān)cdna按SMRTTMRACEcDNAAmplificationKit要求,取1μg總RNA為模板,合成第一條cDNA,以P7和特異性引物P6進(jìn)行5′cDNA末端的擴(kuò)增。條件為94℃變性3min,然后按94℃1min,60℃1min,72℃2min,30個(gè)循環(huán);72℃10min。將PCR產(chǎn)物回收并克隆到pGEM-T載體上,挑選正確的陽(yáng)性克隆測(cè)序。1.3.3序列拼接將部分cDNA序列和3′和5′RACE獲得的序列用DNAMANVersion4.0進(jìn)行序列拼接,結(jié)合測(cè)序峰圖進(jìn)行序列校正,最后獲得拼接好的序列。1.3.4構(gòu)建質(zhì)粒ptted6根據(jù)序列拼接結(jié)果設(shè)計(jì)兩端引物P8和P9,按94℃1min,58℃1min,72℃2min,30個(gè)循環(huán),將PCR產(chǎn)物回收并克隆到pGEM-T載體上構(gòu)建質(zhì)粒pTTED6。引物P8和P9中黑體表示在5′和3′端引入的酶切位點(diǎn)KpnⅠ、EcoRⅠ。1.4質(zhì)粒雙酶切法制備ndf提取的含有雅致枝霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的質(zhì)粒pTTED6,用KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切,回收并與以同樣雙酶切的質(zhì)粒pYES2.0連接,構(gòu)建得到新質(zhì)粒pYTED6(圖1),并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α,以Amp+篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒pYTED6凍存-20℃?zhèn)溆谩?.5酒刑事捐贈(zèng)者1.5.1酒窩反應(yīng)的制備和轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)方法進(jìn)行操作。1.5.2酒刑事酶誘導(dǎo)按文獻(xiàn)方法進(jìn)行操作。1.6母字母菌的脂肪酸甲化按文獻(xiàn)方法進(jìn)行。1.7脂肪酸甲酯化物的合成柱子:彈性石英毛細(xì)管柱,0.32×30m,固相支持物:聚二乙二醇丁二酸酯(Poly-diethyleneglycolsuccinate,DEGS)鍍膜物:聚酰亞胺。載氣:N2,線速:10cm/s。分流比∶100∶1,氣化室溫度:250℃,柱溫:180℃,尾吹:50mL/min,檢測(cè)器:氫火焰離子化檢測(cè)器。以Sigma公司生產(chǎn)的GLA甲酯為標(biāo)準(zhǔn)品,上海生工公司產(chǎn)LA甲酯化后為底物對(duì)照。把上述方法制備的脂肪酸甲酯化的樣品,進(jìn)行GC分析,上樣量為1μL。分析軟件:ANSTAR,分析之星色譜工作站。2結(jié)果2.1基于生物活性的race擴(kuò)增多態(tài)性根據(jù)已報(bào)道的深黃被孢霉、卷枝毛霉、畸雌腐霉、少根根霉的Δ6-脂肪酸脫氫酶同源序列中保守的組氨酸富集區(qū)II(WWKNKHNT)和同源性較高的區(qū)域(HNGMPV)的氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行RT-PCR,獲得長(zhǎng)度約為500bp的片段。將片段回收后,測(cè)序結(jié)果顯示所擴(kuò)增得到的片段全長(zhǎng)為459bp,編碼153個(gè)氨基酸。通過其編碼的氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)進(jìn)行相似性搜索,結(jié)果顯示該cDNA所編碼的氨基酸序列和所搜索得到的序列的相同性在29%～65%,表明已獲得的cDNA序列可能是編碼Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的部分序列。在獲得部分cDNA序列的基礎(chǔ)上,采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)進(jìn)行兩個(gè)末端序列的擴(kuò)增。根據(jù)所獲得的部分cDNA序列設(shè)計(jì)基因特異性引物,進(jìn)行3′和5′cDNA末端擴(kuò)增,結(jié)果分別獲得約500bp和800bp的片段,測(cè)序分析結(jié)果顯示,3′cDNA末端擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為499bp的序列信息,包括22bp的PolyA尾,其和已獲得的部分cDNA序列之間存在104bp的重疊區(qū),即在后者下游延伸出395bp的末端序列。兩個(gè)片段拼接所得到的序列在轉(zhuǎn)譯分析中能形成編碼254個(gè)氨基酸通讀序列,并在PolyA尾上游的第42bp處因存在一個(gè)TAA而中斷,在編碼的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)存在QIEHHVFP序列,和上述真菌來(lái)源的Δ6-脂肪酸脫氫酶的組氨酸富集區(qū)Ⅲ的序列QIEHHLFP基本相同,表明兩者屬于同一cDNA片段。同樣,5′cDNA末端擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為785bp的序列信息,其與已知部分cDNA序列存在74bp的重疊區(qū),即在部分cDNA序列上游延伸出711bp,兩個(gè)片段拼接的序列轉(zhuǎn)譯分析中也獲得了通讀的編碼359個(gè)氨基酸序列,而且存在HDFGHH和WWKNKHNTHH的兩個(gè)組氨酸富集區(qū),與上述已報(bào)道脫氫酶中對(duì)應(yīng)序列相似,這也表明5′RACE擴(kuò)增片段與上述兩個(gè)擴(kuò)增片段屬于同一cDNA。因此,經(jīng)上述3個(gè)步驟的擴(kuò)增,用序列分析軟件將3個(gè)片段進(jìn)行拼接,得到全長(zhǎng)為1504bp的核苷酸序列信息(GenBank,AY941161)。2.2-脂肪酸脫氫酶氨基酸序列的鑒定及與分析通過分析軟件進(jìn)行的序列分析結(jié)果表明,在1504bp的cDNA序列中存在一個(gè)潛在的開放閱讀框,位于5′末端下游36～1413bp之間,全長(zhǎng)為1377bp,編碼459個(gè)氨基酸、分子量為52.4kDa的蛋白和其它已報(bào)道的Δ6-脂肪酸脫氫酶氨基酸序列特別是真菌來(lái)源的相比較,并從編碼蛋白的分子量和序列長(zhǎng)度分析,有可能編碼一個(gè)完整的Δ6-脂肪酸脫氫酶,命名為TED6。ORF兩側(cè)為36bp的5′非轉(zhuǎn)譯區(qū)和91bp的3′非轉(zhuǎn)譯區(qū),而且,在3′末端的polyA尾上游56bp有一個(gè)加尾信號(hào)aataaa,進(jìn)一步表明所獲得片段包含全長(zhǎng)的mRNA3′非轉(zhuǎn)譯區(qū)。將所推測(cè)的氨基酸序列和已報(bào)道真菌的Δ6-脂肪酸脫氫酶氨基酸序列相似性分析表明,該序列和少根根霉、卷枝毛霉、高山被孢霉、深黃被孢霉和畸雌腐霉的Δ6-脂肪酸脫氫酶氨基酸序列具有較大同源性,相同性分別為:87.6%、56.4%、48.8%和48.8%、37.2%。通過氨基酸序列分析結(jié)果顯示在其N端有細(xì)胞色素b5區(qū)HPGG氨基酸位點(diǎn)49-52,氨基酸序列的174～179、211～215和395～399位點(diǎn)具有膜整合酶特異性保守的3個(gè)組氨酸富集區(qū)HDFGHH(HisI)、HNTHH(HisII)和QIEHH(HisⅢ),其中HisⅢ中組氨酸H被谷氨酰胺Q取代和其它真核生物中的Δ6-脂肪酸脫氫酶相同。2.3酵母菌細(xì)胞的脂肪酸為了驗(yàn)證TED6的功能,用重組表達(dá)質(zhì)粒pYTED6(圖1)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞,獲得轉(zhuǎn)基因酵母工程菌株YTED6,經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)后,提取轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞的總脂肪酸。脂肪酸經(jīng)甲酯化后,以γ-亞麻酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品、受體菌INVScl、空載體pYES2.0轉(zhuǎn)化的酵母菌細(xì)胞作為對(duì)照進(jìn)行GC分析(圖2-A)。結(jié)果只有酵母工程菌株YTED6產(chǎn)生保留時(shí)間為14.95min的特殊峰(圖2-B中黑色箭頭所示),與GLA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間14.92min相對(duì)應(yīng),而在空載體和空菌體的對(duì)照樣中沒有出現(xiàn)相應(yīng)的峰。GLA含量占細(xì)胞總脂肪酸含量的7.5%(表2)。2.4gla甲酯衍生物為了進(jìn)一步確證所出現(xiàn)的新峰為GLA甲酯,經(jīng)GC-MS定性分析,然后通過NIST/EPA/NIH數(shù)據(jù)庫(kù)的計(jì)算機(jī)檢索,結(jié)果顯示特殊峰為GLA甲酯(圖3-A),m/z=292表示GLA甲酯化衍生物的分子量,與GLA甲酯標(biāo)準(zhǔn)物(圖3-B)的相同,這些結(jié)果表明TED6的編碼產(chǎn)物能催化外源性亞油酸轉(zhuǎn)化成GLA,具有Δ6-脂肪酸脫氫酶的功能。3討論3.1白超家族氨基酸疏水性變化Δ6-脂肪酸脫氫酶是PUFAs代謝途徑中的限速酶,它也是一種膜整合的脂肪酸脫氫酶,具有特征性的3個(gè)保守的組氨酸富集區(qū)和細(xì)胞色素b5區(qū),目前這些結(jié)構(gòu)特征已成為Δ6-脂肪酸脫氫酶基因克隆的主要依據(jù)。真核生物中的Δ6-脂肪酸脫氫酶是一種定位于微體膜的“front-end”脂肪酸脫氫酶,屬于Cytb5融合蛋白超家族,其特點(diǎn)就是除了3個(gè)保守的組氨酸富集區(qū)外,在氨基酸序列中具有細(xì)胞色素b5區(qū)的結(jié)構(gòu)HPGG。細(xì)胞色素b5區(qū)的存在表明脂肪酸脫氫酶定位于微體膜上,而不是質(zhì)體中,因?yàn)橘|(zhì)體中的脂肪酸脫氫酶一般只利用鐵氧還蛋白作為電子供體。通過Δ9和Δ6-脂肪酸脫氫酶中突變分析證明HPGG起到電子供體的功能,是維持酶活性所必需的。在所獲得cDNA序列所編碼的氨基酸序列中存在上述3個(gè)保守的組氨酸富集區(qū),其N端也具有類似于細(xì)胞色素b5區(qū)的結(jié)構(gòu)HPGG,表明所編碼蛋白也是一種“front-end”脂肪酸脫氫酶。采用Kyte-Doolittle方法進(jìn)行氨基酸疏水性分析(Hydropathyprofile)結(jié)果也表明和已報(bào)道的Δ6-脂肪酸脫氫酶一樣,所推測(cè)的氨基酸序列存在兩個(gè)長(zhǎng)的具有膜整合蛋白特征的疏水結(jié)構(gòu)。如圖4橫線條所示,第1個(gè)疏水區(qū)位于細(xì)胞色素b5區(qū)和第1個(gè)組氨酸富集區(qū)之間,第2個(gè)疏水區(qū)則位于第2個(gè)和第3個(gè)組氨酸富集區(qū)之間,疏水區(qū)形成四次跨膜結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果說(shuō)明所獲得的cDNA序列編碼一個(gè)潛在的Δ6-脂肪酸脫氫酶。3.2gla和gla在6-脂肪酸脫氫酶中的表達(dá)經(jīng)過上述的基因克隆、序列分析,我們初步推測(cè)從雅致枝霉中獲得