冷凍切片制作技術(shù)要點(diǎn)

冷凍切片制作技術(shù)要點(diǎn)

冷凍切片檢查是病理工作中的重要組成部分，在臨床手術(shù)中得到廣泛使用。監(jiān)督和管理的要求是及時(shí)、快速、正確的。手術(shù)中冰凍切片診斷是病理科的急會(huì)診工作,冷凍切片能在術(shù)中及時(shí)確定病變良惡性,為臨床制定進(jìn)一步手術(shù)方案提供依據(jù),其重要性不言而喻。由于冰凍切片診斷時(shí)間倉(cāng)促,取材局限,制片質(zhì)量不如石蠟切片,因此冰凍延遲診斷或誤診時(shí)有發(fā)生?，F(xiàn)將本人工作中發(fā)現(xiàn)的冷凍切片操作中存在的問題及對(duì)策報(bào)告如下。1提交材料1.1不同冷凍機(jī)的預(yù)冷效果組織托是冰凍檢查時(shí)用于支持取材組織塊,使組織保持所需切面,經(jīng)冷凍后進(jìn)行快速冰凍切片制作的必備工具。組織托平常若放置在冷凍機(jī)外常溫下,不進(jìn)行預(yù)冷,將使冷凍時(shí)間延長(zhǎng)。我們做過以下實(shí)驗(yàn),有三種組織用六個(gè)組織托分別取材放入冷凍機(jī),其中三個(gè)組織托是在冷凍機(jī)內(nèi)預(yù)冷過的,另外三個(gè)組織托取自室溫下放置的,結(jié)果,經(jīng)過預(yù)冷的組織托速凍組織時(shí)間比未預(yù)冷組織托快3～5min。所以,在日常工作中我們應(yīng)及時(shí)將冷凍組織托洗凈擦干并置于冷凍機(jī)內(nèi)預(yù)冷備用。1.2包埋劑的使用包埋劑是用來把組織與組織托很好的凝結(jié)在一起,避免切片時(shí)組織從組織托上脫落,延誤時(shí)間。同時(shí),包埋劑還可以避免組織切不全,邊緣粗糙及折、皺等問題,但要注意包埋劑不能加太多,否則會(huì)因冷凍包埋劑而延長(zhǎng)出片時(shí)間。醫(yī)師取材后把組織“載入”已預(yù)凝好的(不能完全凝固)包埋劑,置于冷凍切片機(jī)中速凍制片。有些醫(yī)師加水速凍固定組織,這種做法會(huì)使組織內(nèi)形成冰晶,影響病理診斷。1.3組織侵害塊的檢驗(yàn)標(biāo)本離體后應(yīng)馬上取材冷凍,標(biāo)本表面若附著大量黏液或血液避免用水沖洗,需用紙巾擦拭干凈,組織取材塊不能太大、太厚,否則影響冷凍時(shí)間,大小以1～1.5cm×1～1.5cm,厚2mm為宜,不能超過3mm,盡量少帶或不帶脂肪組織或壞死組織,切面要平整,囊性組織內(nèi)的內(nèi)容物不要用水沖洗,以免切片產(chǎn)生冰晶影響診斷。2溫度2.1不同織物的冷凍溫度要求不同一般來講,肝臟、脾臟、腦組織應(yīng)在-15℃;子宮肌瘤、纖維組織在-18～-20℃;脂肪組織在-25～-30℃。2.2冷凍時(shí)間的影響雖然不同組織溫度要求不同,但在實(shí)際中很難操作,尤其是像只有一臺(tái)冷凍機(jī),并且標(biāo)本量又多,標(biāo)本種類復(fù)雜的病理科,很難完全按照要求滿足冷凍組織。這就是要控制好組織的冷凍時(shí)間。例如把100%定為冷凍標(biāo)準(zhǔn),那么肝、腎、腦等凍到70%左右即可,冷凍時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使組織變脆,易碎,不易切片;肌瘤、纖維等凍到80%左右即可,冷凍時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使組織變硬,不僅容易損刀,而且組織的切片會(huì)出現(xiàn)裂痕、搓板樣等,圖1(封2)是在冷凍程度不同條件下子宮肌瘤切片鏡下觀察,凍到80%組織鏡下無搓板樣、裂痕現(xiàn)象,凍到100%鏡下有搓板現(xiàn)象;脂肪組織必須凍到120%以上,這樣脂肪組織才能凍住,利于切片。3冷凍切片的制作冷凍切片常見的問題有準(zhǔn)備不充分,防卷板使用不當(dāng),貼面不能每切完1次徹底清潔干凈,切片時(shí)用力不均,進(jìn)刀快慢不均,不注意技巧等等。做冷凍切片前,應(yīng)提前調(diào)整好角度,刀要鋒利,刀頭、刀架、組織托等都要上緊,不能有任何松動(dòng)。每切完一張切片都要徹底清潔防卷板及貼面,這樣可防止污染,避免切片皺褶和不能成片,防止刀痕。切片中要注意使用技巧,例如,從組織好切的部位、組織最小面進(jìn)刀,往往容易切片,帶包膜組織最好把包膜放上面,讓刀最后切到,這樣容易切出較完整的切片等。4細(xì)胞退變的測(cè)定冷凍切片固定要求“立刻”固定。所謂“立刻”,就是切完一張要馬上固定在固定液里,不能等切片晾干再固定,更不能用吹風(fēng)機(jī)吹干,否則容易發(fā)生細(xì)胞退變。正確的方法是把固定液置于冷凍機(jī)上,切一張馬上放入固定液里固定一張。固定液的選擇各家醫(yī)院有所不同。目前病理科所用的固定液有五種:95%酒精、甲醇、丙酮、AAF液、10%甲醛。不管選用哪一種,切片固定時(shí)間均應(yīng)為30～50s。切片固定時(shí)間過短,組織水腫,細(xì)胞體積大,易造成判斷失誤;固定太長(zhǎng),細(xì)胞核固縮,核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)不清晰,同樣影響診斷。5控制好切片的分歧染色是制作切片的關(guān)鍵步驟,一是要求染液要新鮮,二是要保證染色試劑的濃度準(zhǔn)確。染液更換不及時(shí),組織紅藍(lán)染色掌握不好,各級(jí)梯度酒精時(shí)間控制不當(dāng),都會(huì)影響切片質(zhì)量。組織細(xì)胞核漿顏色深淺程度,關(guān)鍵要掌握好分化時(shí)間。蘇木素應(yīng)深染、充分分化、返藍(lán),高濃度酒精脫水時(shí)間不宜過短,時(shí)間過短,組織顯微鏡下模糊不清。目前病理科成熟的染色程序?yàn)?切片切好后立刻放入固定液中固定30s→水洗→蘇木素染色1～2min→水洗→鹽酸酒精分化3～5s→水洗→氨水返藍(lán)3～5s→水洗→伊紅染色20～30s→稍洗→梯度酒精脫水→二甲苯透明(最好用三缸二甲苯)→封固。6質(zhì)量?jī)?yōu)良冷凍切片的制作封片是將染色完成后的切片滴加光學(xué)樹脂膠,以蓋玻片覆蓋,便于長(zhǎng)期保存。封片時(shí)最容易出現(xiàn)的問題是滴膠過多,樹膠溢出蓋玻片,造成切片表面污染,歸檔時(shí)切片黏連,難以分開。對(duì)此,技術(shù)操作人員應(yīng)視組織大小及厚薄適量滴加樹膠,熟練掌握封片技術(shù),如有膠液溢出,應(yīng)及時(shí)以少許二甲苯棉簽擦拭周邊,保證切片外觀干凈整潔。怎樣才能制作一張質(zhì)量?jī)?yōu)良的冷凍切片呢?經(jīng)過多年的工作經(jīng)歷和參加全國(guó)冰凍切片大賽經(jīng)驗(yàn),我認(rèn)為,一張優(yōu)良的冷凍切片必須具有切片的完整性,厚薄均勻,無折疊和切痕,組織內(nèi)無冰晶,保證染色核、漿分明,紅藍(lán)適度,組織結(jié)構(gòu)清晰;特別強(qiáng)調(diào)冷凍切片