高原地區(qū)-亞麻酸發(fā)酵條件的優(yōu)化

高原地區(qū)-亞麻酸發(fā)酵條件的優(yōu)化

它通常是一種含有大量脂肪酸的藥物，如豆?fàn)罴に兀╣oa）。它對(duì)糖尿病、皮膚紅斑和心血管疾病的治療都有一定療效。因此，經(jīng)常使用口服營(yíng)養(yǎng)成分的藥物。GLA過去多從月見草籽中提取,這易受種植等因素的限制。微生物發(fā)酵生產(chǎn)GLA具有生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)簡(jiǎn)單且原料不受限制等特點(diǎn),所以越來越受到人們的重視。目前國(guó)內(nèi)多采用被孢霉(Mortierella)發(fā)酵生產(chǎn)GLA,我們以雅致枝霉為出發(fā)菌株,對(duì)其進(jìn)行了誘變育種,獲得高產(chǎn)GLA的誘變株TE7-15。本文對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了研究,旨在開發(fā)生產(chǎn)GLA的新的微生物資源。1材料和方法1.1新型培養(yǎng)基雅致枝霉(Thamnidiumelegans)AS3.3456,中國(guó)科學(xué)院微生物研究所國(guó)家菌種保藏中心;雅致枝霉TE7-15突變株是AS3.3456菌株經(jīng)5-氟尿嘧啶、紫外線和氯化鋰復(fù)合誘變選育而得。斜面培養(yǎng)基:霉菌培養(yǎng)基,北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠;種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30,酵母粉1.0,蛋白胨1.0,麥芽汁1.0,KH2PO42.0,檸檬酸鈉0.5,CuSO40.5×10-3,ZnSO47.5×10-3,MnSO42.0×10-3,pH6.0;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50,酵母粉1.0,蛋白胨5.0,KH2PO42.0,CaCO30.3,MgSO40.3,CuSO40.5×10-3,ZnSO47.5×10-3,MnSO42.0×10-3,檸檬酸鈉2.0,pH6.0。1.2培養(yǎng)三角封裝液菌種在斜面培養(yǎng)基上于15℃培養(yǎng)5d,活化。將活化后的菌種接種于種子培養(yǎng)基,以100ml的三角瓶裝液10ml,在15℃下,120r/min培養(yǎng)24h。在裝有培養(yǎng)基100ml的500ml三角瓶接入種子液,接種量10%,15℃,140r/min培養(yǎng)5d。發(fā)酵液經(jīng)的確良布過濾,蒸餾水洗滌后,稱濕重,取部分濕菌體,100℃烘干至恒重,冷卻后稱干重,以確定菌體得率。1.3分析1.3.1用信息共同加入甲醇過濾法注1濕菌體按每克菌加4mol/LHCl6ml混勻,室溫放置1h,于沸水浴煮沸3min,置于冰室速冷,然后加入氯仿及甲醇(1∶1),混勻后離心,揮發(fā)除去氯仿即得油脂。1.3.2油中脂肪酸的相色譜分析1.3.2.氣相色譜分析油脂加入皂化液(0.5mol/LKOH-甲醇)2ml,混勻,于60℃水浴皂化至油珠消失,冷卻后加入甲酯化液(14%三氟化硼-甲醇)2ml,于60℃水浴甲酯化30min,冷卻后加入正己烷1ml,飽和氯化鈉1ml,離心后取上清液,即可用于氣相色譜分析。1.3.2.2.規(guī)范以高純度的GLA甲酯(Sigma產(chǎn)品,純度99%)作為標(biāo)準(zhǔn)品。1.3.2.檢測(cè)柱及設(shè)備用PE-XL氣相色譜儀分析油脂組成;FAMEWAX石英毛細(xì)管色譜柱,柱長(zhǎng)30m,內(nèi)徑0.32mm,液膜厚0.35μm。檢測(cè)器為氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)。程序升溫條件為:柱溫190℃時(shí),以0.3℃/min升至191℃,再以4℃/min升至225℃,維持15min。2結(jié)果2.1淀粉和蔗糖對(duì)菌體生長(zhǎng)和油脂積累的影響在培養(yǎng)基中加入不同碳源進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)(表1),結(jié)果表明,可溶性淀粉和蔗糖均不利于菌體生長(zhǎng)及油脂積累;蔗糖有利于GLA的合成,但GLA是胞內(nèi)脂肪酸,我們不能以GLA含量作為唯一指標(biāo),必須同時(shí)考察菌體干重及油脂產(chǎn)率,因此只有葡萄糖對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)可以兼顧。2.2gla合成資源的影響本實(shí)驗(yàn)以葡萄糖為碳源,采用不同氮源進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn),結(jié)果(表2)表明,利用尿素作氮源雖然有利于菌體生長(zhǎng),但不利于油脂的積累;(NH4)2SO4有利于促進(jìn)GLA的合成,但不利于菌體生長(zhǎng);而KNO3、蛋白胨對(duì)菌體生長(zhǎng)及GLA產(chǎn)量的影響相近,對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)均可兼顧,但蛋白胨成本較高,所以我們選擇KNO3作為氮源。2.3不同溫度下對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和gla產(chǎn)量的影響我們采用不同溫度進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果(表3)表明,該菌株要求適當(dāng)?shù)牡蜏丨h(huán)境,12℃既有利于菌體生長(zhǎng),也有利于積累油脂并合成GLA。2.4gla合成培養(yǎng)時(shí)間由表4可以看出,隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),菌體生長(zhǎng)、油脂積累都逐漸增多,超過184h油脂積累雖然仍在增多,但菌體生長(zhǎng)逐漸減慢,且GLA合成比例逐漸下降即GLA合成的增加量與培養(yǎng)時(shí)間不成正比,繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間則油脂積累也減少,所以綜合評(píng)價(jià)后,我們選擇培養(yǎng)時(shí)間為10d。2.5培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,我們又進(jìn)行了葡萄糖濃度的選擇、碳/氮比值的選擇,最終確立的培養(yǎng)基組分為(g/L):葡萄糖100,酵母粉1.0,蛋白胨1.0,KNO35.0,KH2PO42.0,CaCO30.3,MgSO40.3,CuSO40.5×10-3,ZnSO47.5×10-3,MnSO42.0×10-3,檸檬酸鈉2.0,pH6.0。培養(yǎng)溫度為12℃,培養(yǎng)時(shí)間為10d。以此條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表5。3gla含量的變化本研究對(duì)雅致枝霉誘變株TE7-15進(jìn)行了優(yōu)化培養(yǎng),調(diào)整了碳源、氮源等指標(biāo),初步確立了發(fā)酵培養(yǎng)條件。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:每升培養(yǎng)物菌體干重為19.04g,油脂含量為2.25g,GLA含量占總脂的27.41%,即每升發(fā)酵液產(chǎn)GLA1.08g,已達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的指標(biāo),為GLA的發(fā)酵生產(chǎn)提供了新的菌株。目前國(guó)內(nèi)利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)GLA的