抗結(jié)核藥物的靶位與靶位

抗結(jié)核藥物的靶位與靶位

核電站桿菌是一種非常頑固的病原體。每年800萬(wàn)人感染淋巴結(jié)，200萬(wàn)人死亡。世界上大多數(shù)人口都感染了伏擊測(cè)試菌。耐藥結(jié)核病和HIV感染不斷增加削弱了宿主的疾病防御體系,致使?jié)摲鼞B(tài)病菌復(fù)蘇或感染那些易感人群,這就使有效地控制結(jié)核病的工作面臨進(jìn)一步的挑戰(zhàn)。盡管結(jié)核病用化療法可治愈,但需要至少服藥6~9個(gè)月。除明顯的毒性外,長(zhǎng)療程也導(dǎo)致患者的依從性較差,從而發(fā)生藥物的選擇性耐藥,而且通常是致命的多藥耐藥。目前對(duì)結(jié)核病的治療主要是由一線藥物異煙肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇聯(lián)用的療法,療程為6個(gè)月。如果由于細(xì)菌的耐藥性或患者對(duì)一種或多種藥物的不耐受而導(dǎo)致治療失敗,則使用二線藥物,即對(duì)氨基水楊酸、卡那霉素、氟喹諾酮、卷曲霉素、乙醇硫異煙胺和環(huán)絲氨酸,這些二線藥物通常較一線藥物的療效差,且具有更嚴(yán)重的不良反應(yīng)。由于在受損害的部位存在代謝沉默、持留或休眠細(xì)菌,而抗分枝桿菌的藥物通常只能殺死生長(zhǎng)期的細(xì)菌,不能殺死持留的細(xì)菌,這就使得對(duì)潛伏期TB的治療異常困難?？s主細(xì)胞與分枝桿菌相互作用,分枝桿菌循環(huán)性重復(fù)感染宿主巨噬細(xì)胞,從而延長(zhǎng)了桿菌的存活期和持留,因而使損傷部位的細(xì)菌幾乎不可能被完全殺滅,這就是結(jié)核分枝桿菌能抵抗化療和宿主免疫進(jìn)攻,并在潛伏狀態(tài)下生存數(shù)十年的獨(dú)特能力,因此很難治療和根除。由于在結(jié)核損傷部位存在異種菌群,或許由于宿主缺乏免疫力,必須采用多藥聯(lián)用,且延長(zhǎng)治療時(shí)間,以預(yù)防持留桿菌引起的結(jié)核病復(fù)發(fā)。因此,在有關(guān)結(jié)核病的研究中,在很大程度上側(cè)重于對(duì)持留菌的生物學(xué)特性的研究以及能更有效殺死持留桿菌的療法研究。多藥耐藥結(jié)核分枝桿菌的不斷增加迫使人們研制即對(duì)耐藥結(jié)核分枝桿菌有效,又可縮短療程的新藥。在過(guò)去40年里未研制出新一類(lèi)的抗結(jié)核藥物。在研制新的抗結(jié)核藥物時(shí),考慮結(jié)核分枝桿菌中的哪些靶位是良好的藥物作用靶位是至關(guān)重要的。最近已有很多這方面的綜述文章。本文將闡述更新的抗結(jié)核藥物進(jìn)展情況。1希望替代藥物1.1抗結(jié)核藥物的活性最近發(fā)現(xiàn)的二芳基喹啉(圖1)因其可縮短治療時(shí)間成為有希望的抗結(jié)核藥物。Andres等在體外用快速生長(zhǎng)的恥垢分枝桿菌進(jìn)行藥物篩選得到一組具有很高抗分枝桿菌活性的二芳基喹啉化合物,在對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造后獲得一個(gè)對(duì)分枝桿菌作用活性最強(qiáng)的化合物R207910,其對(duì)恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌的MIC分別為0.003和0.0301μg/ml,對(duì)其他菌種如大腸埃希菌和金葡菌的活性較低(MIC>32μg/ml)。結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌對(duì)二芳基喹啉發(fā)生耐藥性的頻率為1×10-7~1×10-8。通過(guò)對(duì)耐藥恥垢分枝桿菌和耐藥結(jié)核分枝桿菌的研究發(fā)現(xiàn),由atpE基因編碼的亞單位c發(fā)生了變異,atpE位于分枝桿菌的F1F0質(zhì)子ATP合酶的F0部分,而該酶又是ATP合成和細(xì)胞膜生成的關(guān)鍵酶。進(jìn)一步研究確定,atpE基因突變是分枝桿菌對(duì)二芳基喹啉產(chǎn)生耐藥性的根源,并提出二芳基喹啉的作用靶位是分枝桿菌F1F0質(zhì)子ATP合酶,該酶是分枝桿菌中新的藥物作用靶位。R207910還具有抗MDR-TB的活性,根據(jù)轉(zhuǎn)座子誘變分析,F1F0質(zhì)子ATP合酶是結(jié)核分枝桿菌中的必需酶,該酶對(duì)大腸埃希菌并不是必需的,因在小鼠模型中F1F0突變株仍有活力,只是生長(zhǎng)速率降低,致病力衰減。在已確定感染小鼠模型中,R207910對(duì)結(jié)核分枝桿菌的活性高于異煙肼和利福平,且療程可從4個(gè)月縮短至2個(gè)月。特別值得關(guān)注的是二芳基喹啉與吡嗪酰胺具有協(xié)同作用,二者聯(lián)用是殺滅已感染的脾和肺中病原菌的最有效治療方案。在小鼠和初步人體安全性試驗(yàn)中,R207910表現(xiàn)出極佳的早期和晚期殺菌活性、良好的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì),其半衰期長(zhǎng),且無(wú)明顯毒性,這些特性使人們寄希望二芳基喹啉能用于人類(lèi)結(jié)核病的治療,并使療程縮短。然而,還需要對(duì)R207910的幾個(gè)不尋常特性作進(jìn)一步的解釋。第一,抗分枝桿菌的藥物通常對(duì)快速生長(zhǎng)和慢速生長(zhǎng)的分枝桿菌的殺菌活性不同,如異煙肼、利福平和吡嗪酰胺對(duì)慢速生長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌的活性較高,而對(duì)快速生長(zhǎng)的恥垢分枝桿菌的活性較低,因后者存在外排機(jī)制。然而,二芳基喹啉對(duì)快速生長(zhǎng)的恥垢分枝桿菌的活性高于結(jié)核分枝桿菌,這一現(xiàn)象是相當(dāng)不尋常的。第二,在小鼠模型中,早期和晚期均有很高的殺菌活性是不尋常的,因?yàn)槠渌目菇Y(jié)核藥物僅有早期或晚期的殺菌活性。第三,二芳基喹啉類(lèi)選擇性地作用于分枝桿菌F1F0ATP酶,而且未產(chǎn)生明顯的毒性,該事實(shí)令人不可思議,因?yàn)樵撁覆粌H存在于所有分枝桿菌中,而且還存在于宿主細(xì)胞線粒體中。第四,分枝桿菌應(yīng)該可通過(guò)電子傳遞鏈等方式產(chǎn)生能量或ATP,而并非通過(guò)F1F0ATP酶,故二芳基喹啉對(duì)F1F0ATP酶的抑制作用是非致命性的,除非R207910也可以作用于分枝桿菌中的其他藥物作用靶位。對(duì)于R207910的研究正處于臨床試驗(yàn)階段。1.2莫西瓜星的聯(lián)合療法氟喹諾酮是廣譜抗生素,目前作為結(jié)核病的二線治療藥物。新的C8甲氧基氟喹諾酮莫西沙星和吉米沙星較氧氟沙星和環(huán)丙沙星具有更長(zhǎng)的半衰期及更強(qiáng)的抗結(jié)核分枝桿菌活性。莫西沙星能夠殺死利福平不能殺死的結(jié)核桿菌亞群,在小鼠模型中,莫西沙星對(duì)結(jié)核分枝桿菌的活性與異煙肼相當(dāng)。莫西沙星與異煙肼和吡嗪酰胺聯(lián)用對(duì)小鼠體內(nèi)結(jié)核桿菌的殺菌作用較標(biāo)準(zhǔn)療法(異煙肼+利福平+吡嗪酰胺)更有效,并4個(gè)月即可治愈,無(wú)復(fù)發(fā)。這些研究結(jié)果增強(qiáng)了用莫西沙星代替異煙肼+利福平+吡嗪酰胺,以縮短結(jié)核病治療時(shí)間的希望。在初期人體試驗(yàn)中,與異煙肼相比,莫西沙星對(duì)結(jié)核分枝桿菌具有早期殺菌作用及良好的耐受性。含有莫西沙星的聯(lián)合療法與目前標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合用藥的療效相當(dāng)。目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)評(píng)價(jià)莫西沙星和吉米沙星與利福平和吡嗪酰胺聯(lián)用的療效。這2種藥物有可能用作結(jié)核病治療的一線用藥。1.3利福拉齊抗菌活性為了提高利福霉素類(lèi)藥物抗分枝桿菌的活性并延長(zhǎng)其半衰期,已合成了其衍生物利福噴汀、利福布汀和利福拉齊。1998年FDA已批準(zhǔn)利福噴汀用于治療結(jié)核病,該藥(每周給藥1次)使用安全,耐受性好,目前正在進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)以評(píng)價(jià)其治療潛伏期結(jié)核病的療效。利福拉齊是新的半合成利福霉素衍生物,半衰期長(zhǎng),對(duì)結(jié)核分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、沙眼衣原體、肺炎衣原體和幽門(mén)螺旋桿菌有很高的抗菌活性。在小鼠體內(nèi)外試驗(yàn)中,利福拉齊對(duì)結(jié)核分枝桿菌的活性高于利福平和利福布汀。耐利福平菌株能使所有利福霉素類(lèi)(包括利福拉齊)產(chǎn)生交叉耐藥,故治療耐利福平結(jié)核桿菌引起的結(jié)核病時(shí),限制使用利福拉齊。初步人體安全性研究表明,利福拉齊在劑量為10和25mg是安全的,而在100mg以上時(shí)會(huì)產(chǎn)生流感樣癥狀和暫時(shí)的劑量依賴性白細(xì)胞和血小板減少,而其療效并不比利福平好。利福拉齊用于治療分枝桿菌感染的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)還未見(jiàn)報(bào)道。1.4唑烷酮和利奈唑胺噁唑烷酮類(lèi)具有明顯的抗結(jié)核分枝桿菌活性,MIC為2~4μg/ml,在小鼠模型中也有抗結(jié)核桿菌的活性。Sbardella等已證實(shí)3-(1H-1-吡咯基)噁唑烷酮具有抗分枝桿菌的活性。RBx7644和RBx8700具有抗MDR-TB和巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核桿菌的活性。利奈唑胺是FDA批準(zhǔn)的首個(gè)用于治療單一或多藥耐藥的革蘭陽(yáng)性菌感染的噁唑烷酮類(lèi)藥物。在近期進(jìn)行的2項(xiàng)臨床研究中,大多數(shù)MDR-TB患者用利奈唑胺與其他藥物聯(lián)合治療后康復(fù),但由于在治療MDR-TB時(shí)延長(zhǎng)利奈唑胺用藥時(shí)間,常常引起明顯的毒性,如貧血和末梢神經(jīng)病變。盡管?chē)f唑烷酮類(lèi)在治療MDR-TB很有潛力,還需更廣泛的臨床研究評(píng)價(jià)其療效和毒性,以及分枝桿菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥的程度。1.5pa984對(duì)細(xì)菌的活性硝基咪唑吡喃PA824是5-硝基咪唑衍生物(圖2),對(duì)結(jié)核分枝桿菌和多藥耐藥結(jié)核菌具有很高的抗菌活性,MIC為0.015~0.250μg/ml。PA824是一種前藥,需要由細(xì)菌F420葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(Fgd)和硝基還原酶激活,被激活的組分可抑制細(xì)菌分枝菌酸和蛋白質(zhì)的合成。被激活的PA824的有效部分還有待鑒定。對(duì)耐藥的F420陰性突變株進(jìn)行互補(bǔ)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Fgd能修復(fù)結(jié)核分枝桿菌和鳥(niǎo)分枝桿菌對(duì)藥物的敏感性。在動(dòng)物模型中,PA824對(duì)非生長(zhǎng)期的桿菌有活性(甚至在微需氧的條件下),其活性與異煙肼、利福平和莫西沙星相當(dāng)。在小鼠模型中,PA824在治療的最初2個(gè)月和延長(zhǎng)治療期均具有殺菌活性,這表明PA824對(duì)非生長(zhǎng)期持留桿菌有明顯的體內(nèi)活性。還需進(jìn)一步的研究評(píng)價(jià)PA824與其他藥物聯(lián)用是否能縮短治療時(shí)間而無(wú)明顯的復(fù)發(fā),以及耐藥性和毒性。目前全球抗結(jié)核藥物開(kāi)發(fā)聯(lián)盟正在對(duì)PA824治療結(jié)核病的療效進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。1.6sq109和乙胺丁醇對(duì)小鼠抗結(jié)核分枝桿菌活性的影響治療其他疾病的藥物如抗真菌的唑類(lèi)、酚噻嗪類(lèi)(氯丙嗪和甲硫達(dá)嗪)和氯苯酚嗪衍生物(如氯苯酚嗪)均有良好抗結(jié)核活性,可作為治療結(jié)核病的候選藥物進(jìn)一步評(píng)價(jià)。乙胺丁醇類(lèi)似物SQ109具有良好的抗結(jié)核分枝桿菌活性,MIC為0.5μg/ml,而乙胺丁醇MIC為5.0μg/ml。在小鼠模型中,SQ109對(duì)巨噬細(xì)胞中的結(jié)核分枝桿菌較乙胺丁醇有更高的抗菌活性,但較異煙肼的活性低。SQ109與乙胺丁醇的作用機(jī)制不同,可抑制細(xì)胞壁半乳聚糖的生物合成,并在體內(nèi)、外均有抗結(jié)核分枝桿菌活性,但還沒(méi)有臨床研究的相關(guān)報(bào)道。肽脫甲?；敢种苿〣B3497具有抗結(jié)核分枝桿菌活性,MIC為0.06~2.00μg/ml,可能成為有前景的結(jié)核病治療新藥。吡咯類(lèi)LL3538正處于臨床前研制階段,是有前景的治療結(jié)核藥物。2疾病發(fā)病機(jī)制的作用靶位理想的藥物作用靶點(diǎn)應(yīng)是對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)、代謝和生存起關(guān)鍵作用的位點(diǎn),這些位點(diǎn)的失活將導(dǎo)致細(xì)菌死亡或不能持留。已確定的結(jié)核分枝桿菌基因組序列和分枝桿菌的遺傳工具(如轉(zhuǎn)座子誘變、基因敲除、基因轉(zhuǎn)移)為藥物作用靶位的鑒定奠定了基礎(chǔ)。此外,與疾病發(fā)病機(jī)制有關(guān)的靶點(diǎn)也可以作為藥物的作用靶位,如從固體壞死灶到腔的形成這一液化作用是感染擴(kuò)散到其他個(gè)體的關(guān)鍵步驟。若能夠中止液化和腔形成,病灶部位的桿菌將不會(huì)傳染給他者。因此抑制宿主的液化過(guò)程是用于設(shè)計(jì)可阻止結(jié)核傳播的新藥的一種新方法。新的抗結(jié)核藥物不僅對(duì)耐藥結(jié)核菌有抗菌活性并也能殺死持留菌以及縮短結(jié)核病的治療時(shí)間。目前結(jié)核藥物的作用靶位主要為DNA合成、RNA合成、細(xì)胞壁合成和能量代謝(表1)。目前的結(jié)核藥物所不能抑制的在這些代謝途徑中的酶也是良好的藥物作用靶位。分枝桿菌的雙組分系統(tǒng)、σ因子和毒力因子也可以作為結(jié)核藥物的作用靶位。下面將討論有可能與新藥作用的新靶位。2.1特定基因的生成和功能轉(zhuǎn)座子誘變和信號(hào)標(biāo)簽誘變技術(shù)已用于鑒別結(jié)核分枝桿菌體外生長(zhǎng)和體內(nèi)生存所必需的基因?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)614個(gè)基因是結(jié)核分枝桿菌體外生長(zhǎng)所必需的,約占該菌總基因數(shù)的1/6,而194個(gè)基因是該菌在小鼠體內(nèi)生存所必需的。體外和體內(nèi)生存所必需的基因可按如下分類(lèi):脂類(lèi)代謝、糖和氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、無(wú)機(jī)離子的轉(zhuǎn)動(dòng)和代謝、核苷酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化、分泌、細(xì)胞生物被膜的產(chǎn)生、細(xì)胞分裂、DNA復(fù)制、重組和修復(fù)、轉(zhuǎn)錄和翻譯、翻譯后的修飾、伴侶蛋白、輔酶代謝和信號(hào)傳導(dǎo)。然而這些必需基因中的很多功能是未知的。除采用轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)系統(tǒng)分析必需基因以外,靶向敲除特定基因也是一種鑒定必需基因(即對(duì)這些基因的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡)的有效方法。這些分枝桿菌中的必需基因是抗結(jié)核藥物的很好作用靶位。2.2細(xì)菌、化療后殘留的細(xì)菌分枝桿菌的持留指的是結(jié)核分枝桿菌在化學(xué)治療和(或)肌體免疫壓力下的生存能力。持留菌的性質(zhì)目前尚不清楚,但可能是由穩(wěn)定期的細(xì)菌、化療后仍殘留的細(xì)菌和(或)休眠期的細(xì)菌組成。這些持留菌的存在是結(jié)核病需要長(zhǎng)期治療的主要原因。目前許多研究側(cè)重于了解持留結(jié)核分枝桿菌的生物學(xué)特性,并研制對(duì)持留菌有活性的新藥。已鑒定出持留分枝桿菌的基因產(chǎn)物,如異檸檬酸裂解酶(ICL),PcaA,RelA和DosR與分枝菌酸的修飾有關(guān),故這些基因產(chǎn)物有可能成為抗持留分枝桿菌藥物的作用靶位。2.3細(xì)菌毒副反應(yīng)數(shù)項(xiàng)研究已確定了大腸埃希菌中涉及細(xì)菌細(xì)胞的死亡和存活的毒素和抗毒素配對(duì)基因(稱(chēng)為T(mén)A模塊),如mazEF,higAB,parDE,phd/doc,relBE,vapBC。毒素的表達(dá)不當(dāng)或失控及抗毒素的表達(dá)降低均能導(dǎo)致細(xì)菌死亡。在大腸埃希菌中,一些可分別抑制轉(zhuǎn)錄和翻譯的抗生素(利福平、氯霉素和大觀霉素)及一些可引起胸腺嘧啶饑餓的磺胺藥通過(guò)誘導(dǎo)毒素MazF產(chǎn)生而殺死細(xì)菌。已發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌基因組至少含有38個(gè)TA模塊,包括3個(gè)relBE和9個(gè)mazEF,這些AT模塊是設(shè)計(jì)即可誘導(dǎo)分枝桿菌產(chǎn)生毒素,又可抑制抗毒素表達(dá)藥物的作用靶點(diǎn)。2.4非可小熱發(fā)酵的能量所有細(xì)菌的生存均需要能量。在結(jié)核分枝桿菌中能量產(chǎn)生的途徑并無(wú)明顯特征,最近的研究已證明能量產(chǎn)生途徑是藥物作用的重要靶點(diǎn),如吡嗪酰胺(對(duì)非生長(zhǎng)期持留桿菌的活性比生長(zhǎng)期桿菌更強(qiáng),并縮短了治療結(jié)核病的療程)使結(jié)核桿菌的細(xì)胞膜破裂而耗盡能量起到殺菌的作用。這項(xiàng)研究提示,能量的產(chǎn)生和維持對(duì)于持留的非生長(zhǎng)期結(jié)核桿菌在體內(nèi)的生存非常重要。最近發(fā)現(xiàn)的高效TB治療藥物二芳基喹啉也證明了能量產(chǎn)生途徑對(duì)于分枝桿菌的重要性。因此,能量產(chǎn)生途徑,如電子傳遞鏈、糖酵解途徑和發(fā)酵途徑,均有可能成為結(jié)核病藥物的良好作用靶位。3藥物聯(lián)用篩選除選擇藥物靶位外,還應(yīng)該考慮許多不同的方法,其中之一便是藥物篩選模型的設(shè)計(jì)。除吡嗪酰胺外,目前大多數(shù)抗結(jié)核藥物的發(fā)現(xiàn)是基于其抗生長(zhǎng)期桿菌的體外活性。而對(duì)非生長(zhǎng)期持留菌具有活性的藥物才能縮短治療的時(shí)間,如異煙肼和利福平。因此,新藥的篩選可模擬體內(nèi)病灶的條件(如pH和組織缺氧),對(duì)穩(wěn)定期非生長(zhǎng)桿菌的抗菌活性是鑒定殺持留菌并縮短治療時(shí)間的藥物的重要條件。此外,通過(guò)藥物聯(lián)用的篩選方法可以鑒定聯(lián)合用藥是否具有協(xié)同作用,如可鑒定與吡嗪酰胺或利福平有協(xié)同作用的藥物,以提高其抗結(jié)核作用。遵循藥物聯(lián)用的思路,采用系統(tǒng)生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)新藥格外令人關(guān)注,該方法不同于常規(guī)方法,即篩選作用于單一靶位的單個(gè)藥物,而是使用多種化合物以不同的作用途徑同時(shí)作用于多個(gè)靶位來(lái)達(dá)到預(yù)