生物化工工藝學(xué)-第9章-生物質(zhì)質(zhì)分離與純化

第九章生物物質(zhì)分離與純化研究費(fèi)用中：后處理過程占50%以上。產(chǎn)品成本中：后處理成本占40%-80%。整個(gè)生產(chǎn)過程中：后處理過程占70%-90%。生物反應(yīng)過程示意圖生物催化劑（酶、細(xì)胞、動(dòng)植物）種子生物反應(yīng)器提取精制

無菌空氣

檢測(cè)控制系統(tǒng)

培養(yǎng)基制備與滅菌廢棄物副產(chǎn)物

產(chǎn)品

生物反應(yīng)器---生物反應(yīng)過程的中心（中游加工）

---反應(yīng)前與后的工序稱為上游加工和下游加工上游加工----最重要的是提供和制備高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和足夠數(shù)量的生物催化劑

即應(yīng)用常規(guī)選育、基因工程、細(xì)胞工程和酶工程手段獲得優(yōu)良菌株、細(xì)胞或固定化的菌體等。中游加工-----生物反應(yīng)器為中心下游加工-----從反應(yīng)液中提取目的產(chǎn)物，加工精制成合格產(chǎn)品生物反應(yīng)過程的上、中和下游生物反應(yīng)過程的組成生物反應(yīng)過程生物反應(yīng)器：物料的混合與流動(dòng)、傳質(zhì)與傳熱、氧的傳遞、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、反應(yīng)器的設(shè)計(jì)與放大。上游：生物催化劑的制備、原料的理化處理、熱量傳遞、滅菌動(dòng)力學(xué)。下游：目的產(chǎn)物的提取與精制。一生化產(chǎn)品的特點(diǎn)第一節(jié)概述1含量低2組成復(fù)雜3穩(wěn)定性差，易變性和失活

如pH、溫度、金屬離子、有機(jī)溶劑、剪切力、表面張力的影響。4種類多

如氨基酸、蛋白質(zhì)（酶、抗體、干擾素等）、多肽、糖類、脂類、抗生素等。5對(duì)含量和純度的要求高1條件溫和，需保持其生物活性2選擇性要好、專一性要強(qiáng)，純化效果好3對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的量和活性具有較高的收率4盡量減少工藝步驟5速度快，效率高，以提高生產(chǎn)能力二對(duì)分離技術(shù)的要求三分離純化的一般步驟分離純化包括兩個(gè)基本階段：1產(chǎn)物的初級(jí)分離階段其任務(wù)是分離細(xì)胞和培養(yǎng)液、破碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物、復(fù)原蛋白質(zhì)、濃縮產(chǎn)物、去除大部分雜質(zhì)2產(chǎn)物的純化精制階段其任務(wù)是將目標(biāo)產(chǎn)物和干擾雜質(zhì)盡可能地分開，使產(chǎn)物的純度達(dá)到相關(guān)要求，成為合格產(chǎn)品。分離純化的一般步驟

---見教材P239一主要步驟及作用第二節(jié)培養(yǎng)液的預(yù)處理共主要步驟包括菌體分離、細(xì)胞破碎、固體雜質(zhì)的去除等。其主要作用是改進(jìn)培養(yǎng)液的處理性能，其目的除了分離細(xì)胞、菌體和其它懸浮顆粒外，還需除去培養(yǎng)液中的可溶性雜質(zhì)，以改善培養(yǎng)的過濾性能，以利于分離純化，為純化、精制作準(zhǔn)備。二培養(yǎng)液的預(yù)處理內(nèi)容1高價(jià)無機(jī)離子的去除鈣離子：加入草酸鎂離子：加入三聚磷酸鈉（它可與鎂離子形成鉻合物）鐵離子：加入黃血鹽，形成普魯士藍(lán)沉淀2雜蛋白質(zhì)的去除由于變性蛋白質(zhì)的溶解度較小，故可使其變性而去除。使蛋白質(zhì)變性的方法：（1）加熱；（2）大幅度改變pH值，加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑。3凝聚和絮凝技術(shù)凝聚：在中性鹽作用下，由于雙電層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。絮凝：在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過程。常用的凝聚劑電解質(zhì)有：Al2（SO4）3·18H2O（明礬）；AlCl3·6H2O;ZnSO4;MgCO3常用的高分子聚合物絮凝劑是有機(jī)合成的聚丙烯酰胺類衍生物，分為非離子型、陰離子型和陽離子型。4離心和過濾一細(xì)胞破碎方法的分類第三節(jié)細(xì)胞的破碎機(jī)械法（固體剪切力作用、流體剪切力作用）。非機(jī)械法（化學(xué)或生物化學(xué)滲透、物理滲透）二機(jī)械破碎機(jī)械破碎法處理量大、破碎效率高、速度快，是工業(yè)規(guī)模細(xì)胞破碎的主要手段。包括高壓勻漿、珠磨、撞擊破碎和超聲波破碎等。1高壓勻漿破碎原理：細(xì)胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環(huán)隙高速（450m/s）噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細(xì)胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環(huán)境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。適用于酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎，不適于團(tuán)狀和絲狀菌。2珠磨破碎原理：攪拌槳的高速攪拌使微球高速運(yùn)動(dòng)，微球與微球之間以及微球與細(xì)胞之間發(fā)生沖擊和研磨，使懸浮液中的細(xì)胞受到研磨剪切和撞擊而破碎。適用于絕大多數(shù)微生物細(xì)胞的破碎。3撞擊破碎破碎原理：細(xì)胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)，形成粒徑較小的微粒，高速載氣（如氮?dú)猓鼋Y(jié)的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細(xì)胞發(fā)生破碎。適用于大多數(shù)微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞的破碎。4超聲波破碎破碎原理：在超聲波作用下液體發(fā)生空穴作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。適用于大多數(shù)微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞的破碎。需在冰水或有外部冷卻的容器中進(jìn)行，主要用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎。三物理滲透法1滲透壓沖擊法破碎原理：將細(xì)胞置于高滲透壓的介質(zhì)（如較高濃度的甘油或蔗糖溶液）中，達(dá)到平衡后，將介質(zhì)突然稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)置于低滲透壓的水或緩沖溶液中，在滲透壓的作用下，水滲透通過細(xì)胞壁和膜進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞壁和膜膨脹破碎。適用于：易于破碎的細(xì)胞，如動(dòng)物細(xì)胞和革蘭氏陰性菌。2凍結(jié)-融化法破碎原理：將細(xì)胞凍結(jié)后在室溫緩慢融化，反復(fù)多次使細(xì)胞受到破壞。凍結(jié)的作用是破壞細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)，增加其親水性和通透性胞內(nèi)水結(jié)晶使胞內(nèi)外溶液產(chǎn)生濃度差，在滲透壓作用下引起細(xì)胞膨脹而破裂缺點(diǎn)：效果不顯著。四化學(xué)和生物化學(xué)滲透1酸堿處理破碎原理：蛋白質(zhì)為兩性電解質(zhì)，改變pH值可改變其荷電性質(zhì)使蛋白質(zhì)之間或蛋白質(zhì)與其它物質(zhì)之間的相互作用力降低而易于溶解，以提高目標(biāo)產(chǎn)物溶解度。作用：提高目標(biāo)產(chǎn)物的溶解度。2化學(xué)試劑處理3酶溶破碎原理：用表面活性劑、有機(jī)溶劑等處理細(xì)胞，增大細(xì)胞的通透性。作用：使產(chǎn)物易于釋放。破碎原理：利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。適用于：革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的分解。第四節(jié)沉淀法一鹽析法沉淀是物理環(huán)境的變化引起溶質(zhì)的溶解度降低、生成固體凝聚物的現(xiàn)象。鹽析：蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的溶液中溶解度降低、發(fā)生沉淀的現(xiàn)象。鹽析機(jī)理：（1）當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中逐漸加入電解質(zhì)時(shí)，開始蛋白質(zhì)的溶解增大，出現(xiàn)鹽溶現(xiàn)象。（2）但當(dāng)繼續(xù)加入電解質(zhì)時(shí)，鹽離子的水化作用使蛋白質(zhì)表面疏水區(qū)附近的水化層脫離蛋白質(zhì)，暴露出疏水區(qū)域，從而增大了蛋白質(zhì)表面疏水區(qū)之間的疏水作用，易于發(fā)生凝聚，產(chǎn)生沉淀。

水溶液中蛋白質(zhì)的溶解度一般在生理離子強(qiáng)度范圍內(nèi)最大，而低于或高于此范圍時(shí)溶解度均降低。常用的鹽析劑：硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀或磷酸鈉。二有機(jī)溶劑沉淀法鹽析機(jī)理：向蛋白質(zhì)溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有機(jī)溶劑，水的活度降低。隨著有機(jī)溶劑濃度的增大，水對(duì)蛋白質(zhì)分子表面荷電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，溶液的介電常數(shù)下降，蛋白質(zhì)分子間的靜電引力增大，從而凝聚和沉淀。優(yōu)點(diǎn)：溶劑容易蒸發(fā)除去，不會(huì)殘留在產(chǎn)品中。缺點(diǎn)：容易使蛋白質(zhì)變性失活，且有機(jī)溶劑易燃、易爆，對(duì)安全要求高。三等電點(diǎn)沉淀法機(jī)理：在低的離子強(qiáng)度下，調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)，使蛋白質(zhì)所帶電荷為零，能大大降低其溶解度。優(yōu)點(diǎn)：很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在偏酸性的范圍內(nèi)，而無機(jī)酸通常價(jià)格便宜，而且有些酸如磷酸、鹽酸和硫酸的應(yīng)用為蛋白質(zhì)類食品所允許。缺點(diǎn)：酸化時(shí)，易使蛋白質(zhì)變性失活。四其它沉淀法包括：非離子型聚合物（如PEG）、聚電解質(zhì)（如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、卡拉膠等）和多價(jià)金屬離子（Mn2+；Fe2+；Co2+；Cu2+；Zn2+等）。第五節(jié)膜分離過程

(membraneseparation)一概述1膜分離技術(shù)發(fā)展的歷史膜分離技術(shù)已被國際上公認(rèn)為20世紀(jì)末至21世紀(jì)中期最有發(fā)展前途、甚至?xí)?dǎo)致一次工業(yè)革命的重大生產(chǎn)技術(shù)，所以可稱為前沿技術(shù)，是世界各國研究的熱點(diǎn)。如果將20世紀(jì)50年代初視為現(xiàn)代高分子膜分離技術(shù)研究的起點(diǎn)。截止現(xiàn)在，其發(fā)展致可分為三個(gè)階段：

①50年代為奠定基礎(chǔ)階段；②60年代和70年代為發(fā)展階段，③

80年代至今為發(fā)展深化階段。膜分離技術(shù)在分離物質(zhì)過程中不涉及相變，對(duì)能量要求低，因此和蒸餾、結(jié)晶、蒸發(fā)等需要輸入能量的過程有很大差異；膜分離的條件一般都較溫和，對(duì)于熱敏性物質(zhì)復(fù)雜的分離過程很重要，這兩個(gè)因素使得膜分離成為生化物質(zhì)分離的合適方式。此外它操作方便、結(jié)構(gòu)緊湊、維修費(fèi)用低、易于自動(dòng)化，因而是現(xiàn)代分離技術(shù)中一種效率較高的分離手段，在生化分離工程中具有重要作用。2膜分離技術(shù)在分離工程中的重要作用3膜分離技術(shù)存在的問題①在操作中膜面會(huì)發(fā)生污染，使膜性能降低，故有必要采用與工藝相適應(yīng)的膜面清洗方法;②從目前獲得的膜性能來看，其耐藥性、耐熱性、耐溶劑能力都是有限的，故使用范圍受限;③單獨(dú)采用膜分離技術(shù)效果有限，因此往往都將膜分離工藝與其他分離工藝組合起來使用。二膜分離過程的類型膜分離過程可以認(rèn)為是一種物質(zhì)被透過或被截留于膜的過程，近似于篩分過程，依據(jù)濾膜孔徑的大小而達(dá)到物質(zhì)分離的目的?？砂捶蛛x粒子或分子的大小予以分類。在生物技術(shù)中應(yīng)用的膜分離過程，根據(jù)推動(dòng)力本質(zhì)的不同，可具體分為四類：①以靜壓力差為推動(dòng)力的過程；②以蒸氣分壓差為推動(dòng)力的過程；③以濃度差為推動(dòng)力的過程；④以電位差為推動(dòng)力的過程。1以靜壓力差為推動(dòng)力的膜分離過程以靜壓力差為推動(dòng)力的膜分離有三種：微濾(MF)、超濾(UF)和反滲透(RO)，它們?cè)诹Ｗ踊虮环蛛x分子的類型上具有差別。(1)微濾特別適用于微生物、細(xì)胞碎片、微細(xì)沉淀物和其他在“微米級(jí)”范圍的粒子如DNA和病毒等的截留和濃縮。(2)超濾適用于分離、純化和濃縮一些大分子物質(zhì)，如在溶液中或與親和聚合物相連的蛋白質(zhì)(親和超濾)、多糖、抗生素，也可以用來回收細(xì)胞和處理膠體懸浮液。(3)反滲透海水脫鹽、超純水制備，從發(fā)酵液中分離溶劑如乙醇、丁醇和丙酮以及濃縮抗生素、氨基酸等。2以蒸氣分壓差為推動(dòng)力的膜分離過程(1)膜蒸餾(MD)

用于高純水的生產(chǎn)、溶液脫水濃縮和揮發(fā)性有機(jī)溶劑的分離，如丙酮和乙醇等。膜蒸餾中使用的膜應(yīng)是疏水性微孔膜，氣相透過微孔膜而液相因膜的疏水物性被阻止通過。(2)滲透蒸發(fā)是以蒸氣壓差為推動(dòng)力的過程，但是在過程中使用的是致密(無孔)的聚合物膜。液體擴(kuò)散能否透過膜取決于它們?cè)谀げ牧现械臄U(kuò)散能力------擴(kuò)散系數(shù)的不同。3以濃度差為推動(dòng)力的膜分離過程滲析是一種重要的、以濃度差為推動(dòng)力的膜分離過程，它最主要的應(yīng)用是血液(人工腎)的解毒，也用在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的酶的純化上，使用的是微孔膜如膠膜管。酶的傳統(tǒng)純化辦法是使用滲析袋，從樣品中除去無用的低相對(duì)分子質(zhì)量溶質(zhì)和置換存在于滲透液中的緩沖液，由于在樣品中鹽和有機(jī)溶劑的濃度高，滲透壓的結(jié)果導(dǎo)致水向滲透袋內(nèi)遷移，體積增加，所以滲透在除去多余的低相對(duì)分子質(zhì)量溶質(zhì)的同時(shí)，引進(jìn)了一個(gè)新的緩沖溶液。4以電位差為推動(dòng)力的膜分離過程離子交換膜電滲析(EDTM)，簡稱電滲析，是一個(gè)膜分離過程，在該過程中，離子在電勢(shì)的驅(qū)動(dòng)下，通過選擇性滲透膜，從一種溶液向另一種溶液遷移。

用于該過程的膜，只有共價(jià)結(jié)合的陰或陽離子交換基團(tuán)。陰離子交換膜只能透過陰離子，陽離子交換膜則只能透過陽離子。將離子交換膜浸入電解質(zhì)溶液，并在膜的兩側(cè)通以電流時(shí)，則只有與膜上固定電荷相反的粒子才能通過膜。膜分離法傳質(zhì)推動(dòng)力分離原理應(yīng)用舉例微濾（MF）壓差0.05～0.5篩分除菌，回收菌，分離病毒超濾壓差0.1～1.0篩分蛋白質(zhì)、多肽和多糖的回收和濃縮反滲透壓差1.0～10篩分鹽、氨基酸、糖的濃縮、淡水制造滲析濃差篩分脫鹽，除變性劑電滲析電位差電荷、篩分脫鹽，氨基酸和有機(jī)酸分離滲透氣化壓差、溫差溶質(zhì)與膜的親和作用有機(jī)溶劑與水的分離，共沸物的分離三各種膜分離法的原理和應(yīng)用范圍膜分離法包含著非常豐富的內(nèi)容，在生物分離領(lǐng)域應(yīng)用的膜分離法包括微濾(Microfiltration,MF)、超濾(Ultrafiltration，UF)、反滲透(Reverseosmosis，RO)、透析(Dialysis，DS)、電滲析(Electrodialysis，ED)和滲透氣化(Pervaporation，PV)等，各種膜分離法的原理和應(yīng)用范圍列于上表。一個(gè)容器中間用一張可透過溶劑(水)，但不能透過溶質(zhì)的膜隔開，兩側(cè)分別加入純水和含溶質(zhì)的水溶液。若膜兩側(cè)壓力相等，在濃差的作用下作為溶劑的水分子從溶質(zhì)濃度低(水濃度高)的一側(cè)(A側(cè)，純水)向濃度高的一側(cè)(B側(cè)，水溶液)透過，這種現(xiàn)象稱為滲透。促使水分子透過的推動(dòng)力稱為滲透壓。1反滲透與RO膜一樣，超濾(UF)和微濾(MF)都是利用膜的篩分性質(zhì)，以壓差為傳質(zhì)推動(dòng)力。但與RO膜相比，UF膜和MF膜具有明顯的孔道結(jié)構(gòu)，主要用于截留高分子溶質(zhì)或固體微粒。UF膜的孔徑較MF膜小，主要用于處理不含固形成分的料液，其中相對(duì)分子質(zhì)量較小的溶質(zhì)和水分透過膜，而相對(duì)分子質(zhì)量較大的溶質(zhì)被截留。2超濾和微濾如圖5.3所示，利用具有一定孔徑大小、高分子溶質(zhì)不能透過的親水膜將含有高分子溶質(zhì)和其他小分子溶質(zhì)的溶液(左側(cè))與純水或緩沖液(右側(cè))分隔，由于膜兩側(cè)的溶質(zhì)濃度不同，在濃差的作用下，左側(cè)高分子溶液中的小分子溶質(zhì)(例如無機(jī)鹽)透向右側(cè)，右側(cè)中的水透向左側(cè)，這就是透析。透析原理3透析電滲析是利用分子的荷電性質(zhì)和分子大小的差別進(jìn)行分離的膜分離法，可用于小分子電解質(zhì)(例如氨基酸、有機(jī)酸)的分離和溶液的脫鹽。電滲析操作所用的膜材料為離子交換膜，即在膜表面和孔內(nèi)共價(jià)鍵合有離子交換基團(tuán)，如磺酸基(SO-3）等酸性陽離子交換基和季銨基(N＋R3)等堿性陰離子交換基。鍵合陰離子交換基的膜稱作陰離子交換膜，鍵合陽離子交換基的膜稱作陽離子交換膜。在電場的作用下，前者選擇性透過陰離子，后者選擇性透過陽離子。4電滲析四膜及其特性膜的定義:在一定流體相中，有一薄層凝聚相物質(zhì)，把流體相分隔成為兩部分，這一薄層物質(zhì)稱為膜。膜本身是均勻的一相或是由兩相以上凝聚物質(zhì)所構(gòu)成的復(fù)合體。被膜分隔開的流體相物質(zhì)是液體或氣體。膜的厚度在0.5mm以下，否則就不稱為膜。生物分離過程常用的膜分離技術(shù)為超濾、微濾和反滲透。為實(shí)現(xiàn)高效率的膜分離操作，對(duì)膜材料有如下要求：(1)起過濾作用的有效膜厚度小，超濾和微濾膜的開孔率高，過濾阻力小；(2)膜材料為惰性，不吸附溶質(zhì)(蛋白質(zhì)、細(xì)胞等)，從而使膜不易污染，膜孔不易堵塞；(3)適用的pH和溫度范圍廣，耐高溫火茵，耐酸堿清洗劑，穩(wěn)定性高，使用