蛋白質(zhì)分離-純化-鑒定-2012

生物大分子的制備核酸蛋白質(zhì)4個堿基結(jié)構(gòu)相似理化性質(zhì)接近20個氨基酸極性不同奇妙獨特的結(jié)構(gòu)（空間）1蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)單一蛋白質(zhì)全序列分析強調(diào)結(jié)構(gòu)與功能結(jié)構(gòu)生物學(xué)復(fù)雜混合物部分序列分析數(shù)據(jù)庫匹配進行蛋白質(zhì)鑒定系統(tǒng)生物學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)2蛋白質(zhì)分離純化及鑒定基本原則基本方法目的:獲得一定量、高純度的蛋白質(zhì)3化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)功能方法4沉淀技術(shù)離心技術(shù)電泳技術(shù)色譜技術(shù)濃縮技術(shù)基本方法檢測技術(shù)依賴于被分離蛋白的特性5沉淀技術(shù)離心技術(shù)電泳技術(shù)色譜技術(shù)濃縮技術(shù)鹽、有機溶劑、……離心技術(shù)離子交換、過濾、親和柱、平面、儀器聚丙烯酰胺凝膠電泳免疫電泳,蛋白印跡,毛細管電泳透析、超濾，冰凍干燥,沉淀技術(shù)、離心濃縮技術(shù)6沉淀技術(shù)不同的物質(zhì)置入相同溶液，溶解度 是不同的。改變蛋白質(zhì)在水中的穩(wěn)定因素。從樣品中獲得蛋白成分蛋白組分初分用途原理7沉淀技術(shù)鹽析法——鹽析/鹽溶交替；硫酸銨有機溶劑沉淀法——甲醇/乙醇/丙酮蛋白質(zhì)沉淀法——對一類或一種蛋白有效.凝集素對糖蛋白聚乙二醇沉淀法——非離子型聚合物選擇性沉淀法——改變理化因子結(jié)晶沉淀法——特定條件下改變?nèi)芙舛?沉淀技術(shù)離心技術(shù)電泳技術(shù)色譜技術(shù)濃縮技術(shù)鹽、有機溶劑離心技術(shù)離子交換、過濾、親和柱、平面、儀器聚丙烯酰胺凝膠電泳免疫電泳,蛋白印跡,毛細管電泳透析、超濾，冰凍干燥,沉淀技術(shù)、離心技術(shù)9離心技術(shù)細胞組分的初分亞細胞組分純化蛋白質(zhì)分離（沉降系數(shù)）10RCF(relativecentrifugefield)相對離心場以重力常數(shù)g的倍數(shù)表示RCF＝1.11X105X（轉(zhuǎn)數(shù)/分）2Xrrpm(roundpermin)(revolutionperminute)

原理質(zhì)量大小形狀密度11基本構(gòu)成部件

完備部件12離心機13DifferentialCentrifugation.Cellsaredisruptedinahomogenizerandtheresultingmixture,calledthehomogenate,iscentrifugedinastep-by-step

fashionofincreasingcentrifugalforce.Thedensermaterialwillformapelletatlowercentrifugalforcethanwilltheless-densematerial.Theisolatedfractionscanbeusedforfurtherpurification.差級離心質(zhì)量或密度不同1415沉降平衡離心沉降速度離心沉降系數(shù)差異，形狀與密度可能相似顆粒密度差異(等密度梯度離心)(區(qū)帶速度離心)密度梯度離心樣品任何組分的密度要大于介質(zhì)梯度密度介質(zhì)最大密度大于樣品組分的最大密度16CellseparationsSubcellularparticlesVirusesProteinseparationsRateZonalCentrifugation

沉降速度離心17ZonalCentrifugation.

Thestepsareasfollows:(A)formadensitygradient,(B)layerthesampleontopofthegradient,(C)placethetubeinaswinging-bucketrotorandcentrifugeit,and(D)collectthesamples18ViralisolationsSubcellularparticlesIsopycnicCentrifugation等密度點在離心場能自行形成密度梯度沉降平衡離心19IsolationofroughERWhencellsaredisrupted,theERfragmentsintosmallvesiclescalledmicrosomes(微粒體）.ThemicrosomesderivedfromtheroughER(roughmicrosomes)arelinedwithribosomesontheiroutersurface.BecauseribosomescontainlargeamountsofRNA,theroughmicrosomesaredenserthansmoothmicrosomesandcanbeisolatedbyequilibriumdensity-gradientcentrifugation.例20Separationoforganellesfromratliverbyequilibriumdensity-gradientcentrifugation.Forexample,thematerialdepositedasapelletbycentrifugationat15,000gcanberesuspendedandlayeredonadensitygradientcomposedoflayersofincreasinglymoredensesucrosesolutionsinacentrifugetube.Undercentrifugation,eachorganellemigratestoitsappropriateequilibriumdensityandremainsthere.Toobtainagoodseparationoflysosomesfrommitochondria,theliverisperfusedwithasolutioncontainingasmallamountofdetergentbeforethetissueisdisrupted.Thedetergentistakenintothecellsbyendocytosisandtransferredtothelysosomes,makingthemlessdensethantheywouldnormallybe,therebyaffordinga"clean"separationfromthemitochondria可測定樣品密度EquilibriumDensity-gradientCentrifugation例21Comparisonofvelocitysedimentationandequilibriumsedimentation沉降平衡離心沉降速度離心通常用氯化銫通常用蔗糖22沉淀技術(shù)離心技術(shù)電泳技術(shù)色譜技術(shù)濃縮技術(shù)鹽、有機溶劑離心技術(shù)離子交換、過濾、親和柱、平面、儀器聚丙烯酰胺凝膠電泳免疫電泳,蛋白印跡,毛細管電泳透析、超濾，冰凍干燥,沉淀技術(shù)、離心技術(shù)23色譜（層析）對多組分復(fù)雜混合物

的分離、分析（定性與定量）

檢測過程分離過程色譜色譜是對混合物分離分析的過程,包括分離技術(shù)和檢測技術(shù)24色譜過程固定相(+擔(dān)體)流動相樣品差速遷移柱色譜25平面色譜26混合物在固定相和流動相中分配原理不同固體、液體或柱、平面氣體、液體、超臨界流體吸附，分配，離子交換，排阻，親和液－固氣－固正相反相滲透過濾27色譜分類方法超臨界流體色譜法SFC氣相色譜法GC液相色譜法LC離子交換色譜法分配色譜法吸附色譜法排阻色譜法(分子篩）親和色譜法紙色譜法薄層色譜法柱色譜法平面色譜法常壓高壓(高效)28色譜分離機理——離子交換色譜固定相——離子交換樹脂產(chǎn)生差速遷移的基礎(chǔ)離子交換能力的不同離子交換樹脂的可交換離子

與流動相中組分離子發(fā)生交換反應(yīng)也是組分離子

與流動相內(nèi)的離子

對固定相上離子競爭交換的過程適宜于分離相對分子量>20000的蛋白質(zhì)，可以保持蛋白質(zhì)等生物大分子的天然構(gòu)象和生物活性2930色譜分離機理——排阻色譜固定相——凝膠產(chǎn)生差速遷移的基礎(chǔ)分子的大小、形狀應(yīng)用范圍

測定蛋白分子量更換蛋白的緩沖溶液脫鹽純化回收問題活性測定是小分子的去除31分子篩32色譜分離機理——親和色譜固定相——與待分離物質(zhì)具有特定關(guān)系的物質(zhì)產(chǎn)生差速遷移的基礎(chǔ)物質(zhì)親和力的差異缺點必須找到合適的配體；價格優(yōu)點專一性強因而層析產(chǎn)物純度高3334色譜洗脫方式等度洗脫線形梯度洗脫分步洗脫自始至終用一種洗脫液洗脫液可以是幾種充分，以一定規(guī)律改變其濃度，或pH，或離子強度等不同洗脫液更換35柱色譜中使用的檢測方法

UV280

生物活性檢測器UV熒光電化學(xué)電導(dǎo)36平面色譜中使用的檢測方法顯色試劑熒光紫外37Proteinpurificationbychromatography色譜圖洗脫曲線38HPLC簡單介紹泵色譜柱（多種類型）檢測器（多種類型）數(shù)據(jù)采集進樣器柱溫箱39LC—MS色質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)譜儀多維液相色譜分離

蛋白質(zhì)組學(xué)色譜技術(shù)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究40雙向凝膠電泳非凝膠技術(shù)局限性（1）低豐度蛋白和膜蛋白的檢測（2）堿性蛋白質(zhì)的分離與檢測（3）分子量大小的限制（4）重復(fù)性問題（5）有限的動態(tài)范圍（6）自動化問題一維和多維的非凝膠技術(shù)高效、快速、自動化程度高、靈敏度高檢測限(>100kDa、<10kDa)

二維色譜分離蛋白質(zhì)有多種組合模式離子交換色譜/凝膠過濾色譜∽反相色譜

41二維凝膠電泳多維色譜-MS凝膠圖像分析酶解酶解樣品（組織、細胞等）二維數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫檢索蛋白質(zhì)鑒定肽混合物肽階梯序列肽指紋譜肽序列標(biāo)簽MS4243沉淀技術(shù)離心技術(shù)電泳技術(shù)色譜技術(shù)濃縮技術(shù)鹽、有機溶劑離心技術(shù)離子交換、過濾、親和柱、平面、儀器聚丙烯酰胺凝膠電泳免疫電泳,蛋白印跡,毛細管電泳透析、超濾，冰凍干燥,沉淀技術(shù)、離心技術(shù)44電泳技術(shù)原理用途45除了電荷作用，同時具有分子篩作用46SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresis(SDS)

消除了原攜帶電荷的差別，遷移僅與分子量有關(guān)47ElectrophoresisCanDetermineMass.

TheelectrophoreticmobilityofmanyproteinsinSDS-polyacrylamidegelsisinverselyproportionaltothelogarithmoftheirmass.48ThegelisstainedwithCoomassieblue.Thepositionsofsomeofthemajorproteinsinthegelareindicatedinthedrawing.SDSpolyacrylamide-gelelectrophoresispatternoftheproteinsinthehumanredbloodcellmembrane.

491-450Two-dimensionalgelelectrophoresis,atechniqueforseparatingproteinsbasedontheirchargeandtheirmass.

蛋白質(zhì)組學(xué)51免疫電泳分離與鑒定一次完成52WesternblottingIsolation