生物化學(xué)-3(蛋白質(zhì)-1)-2011-9

第二章蛋白質(zhì)化學(xué)〔教學(xué)目的與要求〕

1.了解蛋白質(zhì)元素組成特點及功能。2.了解氨基酸的結(jié)構(gòu)特點及基本性質(zhì)。3.了解氨基酸的分類方法及理論依據(jù)。4.掌握蛋白質(zhì)不同結(jié)構(gòu)層次的概念、研究內(nèi)容及相互關(guān)系。5.掌握蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。6.掌握常見蛋白質(zhì)分離、純化、測定的方法及原理。

第一節(jié)蛋白質(zhì)化學(xué)組成及生理功能從1864年Hoppe-seyler結(jié)晶出第一個天然蛋白質(zhì)—血紅蛋白質(zhì)至今，已經(jīng)有數(shù)千種蛋白質(zhì)被分離提純、并得到的結(jié)晶體。

一、蛋白質(zhì)的元素組成

主要元素：CHONS

C：50%H：7%O：23%N：16%S：0－3%

蛋白質(zhì)平均含N量為16％,這是凱氏定氮法測蛋白質(zhì)含量的理論依據(jù)：

粗蛋白質(zhì)含量＝蛋白質(zhì)含N量×6.25微量:PFeZnCuMoIMgCl等

P：牛奶中的酪蛋白含磷

Fe:血中的血紅蛋白含鐵

I：甲狀腺中甲狀腺球蛋白含碘

三聚氰胺與假蛋白

三聚氰胺為重要的氮雜環(huán)有機化工原料,分子式C3N6H6、C3N3(NH2)3，分子量126.12。其含氮量為66.6%，是牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，就能提高0.4%蛋白質(zhì)含量。由于食品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量測試方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人用作食品添加劑，以提升食品檢測中的蛋白質(zhì)含量指標(biāo)，因此三聚氰胺也被人稱為“蛋白精”。

二、蛋白質(zhì)的水解酸水解

條件：5～10倍的20%的鹽酸煮沸回流16～24小時，或加壓于120℃水解2小時。優(yōu)點：可蒸發(fā)除去鹽酸，水解徹底，終產(chǎn)物為L-α-氨基酸，產(chǎn)物單一，無消旋現(xiàn)象。缺點：色氨酸破壞，并產(chǎn)生一種黑色的物質(zhì)：腐黑質(zhì)，水解液呈黑色。堿水解條件：4mol/LBa(OH)2或6mol/LNaOH煮沸6小時。優(yōu)點：水解徹底，色氨酸不被破壞，水解液清亮。缺點：產(chǎn)生消旋產(chǎn)物，破壞的氨基酸多，一般很少使用。酶水解條件：蛋白酶如胰蛋白酶、糜蛋白酶，常溫37～40℃，pH值5～8。優(yōu)點：氨基酸不被破壞，不發(fā)生消旋現(xiàn)象。缺點：水解不完全，中間產(chǎn)物多。

蛋白質(zhì)的酸、堿水解常用于蛋白質(zhì)的氨基酸組成分析；而酶水解用于制備蛋白質(zhì)部分水解產(chǎn)物及蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定。

◆

蛋白質(zhì)（protein）存在于所有的生物細(xì)胞中，是含量最豐富、功能最復(fù)雜的生物大分子。是構(gòu)成生物體最基本的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。

◆蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，它參與了幾乎所有的生命活動過程。蛋白質(zhì)的主要生理功能:催化功能；結(jié)構(gòu)功能；調(diào)節(jié)功能；防御功能；運動功能；運輸功能；信息功能；儲藏功能

三、蛋白質(zhì)的生理功能2.催化作用：在體內(nèi)催化各種物質(zhì)代謝反應(yīng)的酶幾乎都是蛋白質(zhì)。3.調(diào)節(jié)作用：一些激素是蛋白質(zhì)或肽，如胰島素、生長素；神經(jīng)遞質(zhì)、鈣調(diào)蛋白、阻遏蛋白。4.運輸作用：如紅細(xì)胞中運輸O2、CO2要靠血紅蛋白(Hb)、運輸脂類物質(zhì)的是載脂蛋白、運鐵蛋白等轉(zhuǎn)運蛋白或叫載體蛋白；膜轉(zhuǎn)運蛋白。1.蛋白質(zhì)順序異構(gòu)現(xiàn)象是蛋白質(zhì)生物功能多樣性和種屬特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

5.運動作用：如心跳、胃腸蠕動等，依靠與肌肉收縮有關(guān)的蛋白質(zhì)來實現(xiàn)，如肌球蛋白、肌動蛋白。6.有機體的結(jié)構(gòu)成分：膠原蛋白、纖維蛋白等7.營養(yǎng)作用：用作有機體及其胚胎或幼體生長發(fā)育的原料。卵清蛋白、酪蛋白、種子貯藏蛋白8.防御功能：免疫球蛋白、病毒外殼蛋白、干擾素。免疫反應(yīng)-（抗體;抗原）9.信息傳遞的作用：

如口腔中的味覺蛋白、視網(wǎng)膜中的視覺蛋白受體、生物膜上的受體蛋白10.其它：甜味蛋白、毒素蛋白等都具有特異的生物學(xué)功能。結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)建生命體的材料（沒有不含蛋白的生物體）如a-角蛋白、膠原蛋白催化作用高效專一地催化機體內(nèi)幾乎所有的生化反應(yīng)酶調(diào)節(jié)作用通過體液，神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)機體代謝活動有序進(jìn)行如激素、神經(jīng)遞質(zhì)、鈣調(diào)蛋白、阻遏蛋白運輸作用專一運輸各種小分子和離子如血紅蛋白、膜蛋白防御作用防御異體侵入機體，清除抗原，具高度專一性如免疫球蛋白、病毒外殼蛋白、干擾素營養(yǎng)作用氨基酸貯庫，用于生長發(fā)育或某些物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合而被貯存如卵清蛋白、酪蛋白、種子貯藏蛋白運動作用負(fù)責(zé)機體的運動如肌動蛋白、肌球蛋白第二節(jié)蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位─-----氨基酸一、氨基酸的結(jié)構(gòu)特點（一）氨基酸的結(jié)構(gòu)通式不變部分可變部分（二）氨基酸的構(gòu)型構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸除甘氨酸外，均含有α-碳原子，在空間各原子有兩種排列方式：L-構(gòu)型與D-構(gòu)型，它們的關(guān)系就像左右手的關(guān)系，互為鏡像關(guān)系，下圖以丙氨酸為例：1、所有的天然氨基酸都含有α-氨基。2、不同的氨基酸的主要差異是在R-側(cè)鏈上。3、除甘氨酸外，所有天然氨基酸都含有不對稱碳原子（手性碳原子），都具有旋光性(右旋（＋）和左旋（－）)

。4、存在著L-型和D-型兩種立體異構(gòu)體。構(gòu)成蛋白質(zhì)的所有天然氨基酸都屬于L-型。

從氨基酸的結(jié)構(gòu)通式和構(gòu)型可以看出：

二、氨基酸的分類自然界中游離存在的AA有300多種，生物體中發(fā)現(xiàn)的AA已有180多種，但構(gòu)成蛋白質(zhì)的AA只有20種名稱（三句半口訣）甘丙纈亮異蘇絲半蛋天谷精賴苯酪組色脯AA的名稱常使用三字母的簡寫符號表達(dá)，也使用單字母的簡寫符號表示--主要用于表達(dá)長多肽鏈的AA順序標(biāo)準(zhǔn)AA的區(qū)別在于R基團(tuán)，所以按R基的結(jié)構(gòu)和極性不同進(jìn)行分類二十種常見蛋白質(zhì)氨基酸的分類、結(jié)構(gòu)及三字符號

據(jù)營養(yǎng)學(xué)分類

必需ＡＡ非必需ＡＡ據(jù)R基團(tuán)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類

脂肪族ＡA（中性、含羥基或巰基、酸性、堿性）芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)雜環(huán)ＡＡ(His、Pro)據(jù)R基團(tuán)極性分類極性R基AA非極性R基AA（８種）不帶電荷（７種）帶電荷：正電荷（３種）負(fù)電荷（２種）據(jù)氨基、羧基數(shù)分類一氨基一羧基ＡＡ（15種）一氨基二羧基ＡＡ(Glu、Asp)二氨基一羧基ＡＡ(Lys、Arg、His)（一）按氨基酸分子中羧基與氨基的數(shù)目1.酸性氨基酸：一氨基二羧基氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、2.堿性氨基酸：二氨基一羧基氨基酸：賴氨酸、精氨酸、組氨酸3.中性氨基酸：一氨基一羧基氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸。酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺（Gln,Q）堿性氨基酸

賴氨酸（Lys,K）精氨酸（Arg,R）組氨酸（His,H）雜環(huán)甘氨酸（Gly,G）丙氨酸（Ala,A）纈氨酸（Val,V）亮氨酸（Lue,L）異亮氨酸（Ile,I）含羥基或硫脂肪族氨基酸絲氨酸（Ser,S）蘇氨酸（Thr,T）半胱氨酸（Cys,C）甲硫氨酸（Met,M）中性脂肪族氨基酸雜環(huán)氨基酸

組氨酸（His,H）脯氨酸（Pro,P）芳香族氨基酸

苯丙氨酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Trp,W）（二）據(jù)營養(yǎng)學(xué)價值分類1.必需氨基酸：指人體內(nèi)不能合成的氨基酸，必須從食物中攝取，有八種：賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸。2.半必需氨基酸：指人體內(nèi)可以合成但合成量不能滿足人體需要（特別是嬰幼兒時期）的氨基酸，有兩種：組氨酸、精氨酸。

3.非必需氨基酸：指人體內(nèi)可以合成的氨基酸。有十種。LysTrpPheValMetLeuIleThr

Arg、His物理性質(zhì)1、溶解度2、熔點及旋光度3、味感4、光吸收特性化學(xué)性質(zhì)1、兩性解離性質(zhì)及等電點。2、與金屬離子的反應(yīng)3、與甲醛的反應(yīng)4、與茚三酮的反應(yīng)三、氨基酸的理化性質(zhì)（一）物理性質(zhì)1.形態(tài)：均為白色結(jié)晶或粉末，不同氨基酸的晶型結(jié)構(gòu)不同。2.溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，在稀酸和稀堿中溶解性好。3.熔點：氨基酸的熔點一般都比較高，一般都大于200℃，超過熔點以上氨基酸分解產(chǎn)生胺和二氧化碳。4..旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。5.光吸收：氨基酸在可見光范圍內(nèi)無光吸收，在近紫外區(qū)含苯環(huán)氨基酸有光的吸收。（二）化學(xué)性質(zhì)1.氨基酸的兩性電離及等電點：

氨基酸既含有氨基，可接受H+，又含有羧基，可電離出H+，在水中既起酸（質(zhì)子供體）的作用,又起堿（質(zhì)子受體）的作用，所以氨基酸具有酸堿兩性性質(zhì)。通常情況下，氨基酸以兩性離子的形式存在，如下圖所示：

實驗證明在等電點時，氨基酸主要以兩性離子形式存在，但也有少量的而且數(shù)量相等的正、負(fù)離子形式，還有極少量的中性分子。當(dāng)溶液的pH=pI時，氨基酸主要從兩性離子形式存在。

pH<pI時，氨基酸主要以正離子形式存在。pH>pI時，氨基酸主要以負(fù)離子形式存在。

pH=pI

凈電荷=0

pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負(fù)CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3++H++

OH-+H++

OH-(pK′1)(pK′2)

從上圖可知：氨基酸在酸性環(huán)境中，主要以陽離子的形式存在，在堿性環(huán)境中，主要以陰離子的形式存在。在某一pH環(huán)境下，以兩性離子（兼性離子）的形式存在。

當(dāng)氨基酸溶液在某一定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負(fù)電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該氨基酸的等電點(isoelectricpoint，PI)。所以氨基酸的等電點可以定義為：氨基酸所帶正負(fù)電荷相等時的溶液pH。二十種氨基酸的pK，及等電點：

PI的用途：分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)、AA制劑；在藥物使用上可用改變PI的方法延長療效。當(dāng)PH＝PI時：（1）帶凈電＝0，電場上不移動，導(dǎo)電性最小。（2）溶解度最小，最易沉淀，粘度最小。2.由α-氨基參加的反應(yīng)：

(1)與亞硝酸反應(yīng)：室溫下，HNO2可以與游離α-NH2的AA反應(yīng)，定量地釋放出氮氣，氮氣的一半來自氨基氮，一半來自亞硝酸，在通常情況下測定生成的氮氣的體積量可計算氨基酸的量，此反應(yīng)可用于測定蛋白質(zhì)的水解程度。意義：（1）釋放的N2中的N，1/2來自AA，故可以通過測釋放的N2的體積定量計算AA的量。（2）可以用來測定蛋白質(zhì)的水解程度（因只與游離α-NH2反應(yīng)，所以水解越完全，釋放的N2越多）。(2)與甲醛的反應(yīng)：用過量的中性甲醛與氨基酸反應(yīng)，可游離出氫離子，然后用NaOH滴定，從消耗的堿量可以計算出氨基酸的含量。此法稱為間接滴定法。意義：（1）甲醛過量時，用酚酞作指示劑，用NaOH滴定可以依NaOH用量判斷出游離AA的量。（2）可以用來檢測蛋白質(zhì)的水解程度。

(3)與2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)（sanger反應(yīng)）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黃色)++HF弱鹼中氨基酸意義：

DNP-AA呈黃色，多肽和蛋白質(zhì)N’末端的AA也可以與之形成DNP-多肽或DNP-Pr，之后使該多肽或蛋白質(zhì)水解，酰胺鍵斷裂，而DNP-AA鍵不斷裂，可以用乙醚將其抽提出來（DNP-AA與其它AA在有機溶劑中溶解度不同），進(jìn)行紙層析，根據(jù)在紙上黃色斑點的位置可鑒定N’末端的AA的種類,常用于蛋白質(zhì)的N-末端的測定。

(4)與苯異硫氰酯（PITC）的反應(yīng)（Edman反應(yīng)）

PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物(PTH-AA)

（phenylisothiohydantion-AA）弱鹼中(400C)(硝基甲烷400C)H+NH2少1個AA的多肽多肽PTC-多肽意義在多肽和蛋白質(zhì)的AA順序分析方面占有重要作用。肽鏈N-末端的AA可以形成PTC-多肽，在無水酸中可以釋放出PTH-AA和比原來少一個AA的多肽段，PTH-AA可用乙酸乙酯抽提，紙層析，可確定N-末端AA的種類，余下的多肽段可利用此方法進(jìn)行反復(fù)測定，從而測出該多肽段的順序

3.α-羧基參加的反應(yīng)：(1)與堿反應(yīng)成鹽(2)與醇反應(yīng)成酯(3)與?；噭┓磻?yīng)成酰氯

4.α-羧基和α-氨基共同參與的反應(yīng)

（1）、氨基酸與茚三酮反應(yīng)+3H20水合茚三酮(無色)NH3CO2RCHO+還原性茚三酮紫色化合物(弱酸)加熱水合茚三酮+2NH3+還原性茚三酮應(yīng)用：1、可以作為顏色反應(yīng)，用來定性鑒定AA，（除Pro呈黃色）。2、用分光光度法根據(jù)藍(lán)色深淺定量測定AA。3、測定CO2的量，從而可計算參加反應(yīng)的AA的量。4、在AA紙層析中用茚三酮作呈色劑。5、可根據(jù)此反應(yīng)的靈敏度分析出肽鏈長短（越長則反應(yīng)越不靈敏）。圖1-10紙層析示意圖

Rf

=

溶質(zhì)層析點中心到原點中心的距離----------------------溶劑前沿到原點中心的距離（2）成肽反應(yīng)

5.側(cè)鏈反應(yīng)（顏色反應(yīng)）(1)

Millon反應(yīng)：檢測Tyr或含Tyr的蛋白質(zhì)的反應(yīng)。

Millon試劑：汞的硝酸鹽與亞硝酸鹽溶液。

產(chǎn)物：紅色的化合物。(2)

Folin反應(yīng)：檢測Tyr或含Tyr的蛋白質(zhì)的反應(yīng)。Folin試劑：磷鉬酸、磷鎢酸混合溶液。

產(chǎn)物：藍(lán)色的鉬藍(lán)、鎢藍(lán)。(3)

坂口反應(yīng)：檢測Arg或含Arg的蛋白質(zhì)的反應(yīng)。

坂口試劑：α—萘酚的堿性次溴酸鈉溶液。

產(chǎn)物：磚紅色的沉淀。(4)

Pauly反應(yīng)：檢測His、Tyr及含His、Tyr蛋白質(zhì)的反應(yīng)。試劑：對氨基苯磺酸鹽酸溶液、亞硝酸鈉、碳酸鈉混合溶液產(chǎn)物：橘紅色的化合物。(5)乙醛酸的反應(yīng)：檢測Trp或含Trp蛋白質(zhì)的反應(yīng)。當(dāng)Trp與乙醛酸和濃硫酸在試管中疊加時，產(chǎn)生分層現(xiàn)象，界面出現(xiàn)紫色環(huán)。(6)Cys的反應(yīng)：Cys或含Cys蛋白質(zhì)與亞硝基亞鐵氰酸鈉在稀氨的溶液中，產(chǎn)生一種紅色的化合物。第三節(jié)肽一、肽和肽鍵

肽

一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的氨基之間失水形成的化合物稱為肽。

肽鍵失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵。肽鍵的形成及肽的主鏈結(jié)構(gòu)

由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。

構(gòu)成肽鏈的氨基酸已殘缺不全，稱為氨基酸殘基。

通常在多肽鏈的一端含有一個游離的

-氨基，稱為氨基末端或N-末端（“H”），而另一端含有一個游離的

-羧基，稱為羧基末端或C-末端（“OH”）。

肽鏈中的氨基酸的排列順序，一般-NH2端開始，由N端（左）→C端（右），即多肽鏈有方向性，N端為頭，C端為尾。

肽鏈書寫方式：N端（左）→C端（右）二肽三肽四肽二肽→+肽稱寡肽（oligopeptide）多肽（Polypeptide）二、天然存在的某些活性肽

（一）谷胱甘肽（GSH）

三肽（Glu-Cys-Gly），廣泛存在于生物細(xì)胞中，含有自由的巰基，具有很強的還原性，可作為體內(nèi)重要的還原劑，保護(hù)某些蛋白質(zhì)或酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。

谷胱甘肽的作用：

1、破壞內(nèi)源性過氧化物和自由基（抗氧化）防止過氧化物積累。2、去除外源性化合物的毒性，維護(hù)蛋白質(zhì)活性中心中的巰基的穩(wěn)定（解毒）。3、參與AA的跨膜運輸。4、參與氧化還原過程，作為某些氧化還原酶的輔因子。（二）腦啡肽（神經(jīng)肽）Met-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的有幾十種，有：5肽化合物－－腦啡肽；31肽化合物－－β內(nèi)啡肽；11肽－－P物質(zhì)。其中腦啡肽的鎮(zhèn)痛作用比嗎啡還強，同時是生物體自身合成的“鴉片劑”，所以不具成癮性，目前已被人工合成β內(nèi)啡肽的鎮(zhèn)痛作用比腦啡肽還強，可用于晚期癌癥的解痛，同時其對精神分裂癥及憂郁癥病人的癥狀有明顯的改善作用；短桿菌肽S（三）抗菌素肽（四）多肽激素

#屬蛋白質(zhì)類，由基因工程法生產(chǎn)大多是數(shù)十年研究的多肽激素一、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次的劃分二、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)三、多肽主鏈折疊的空間限制和

維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用力四、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)五、蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域六、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)七、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)第四節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)分子是由一條或多條多肽鏈按照各自的特殊方式組合成的具有完整生物活性的生物大分子。

蛋白質(zhì)與多肽無嚴(yán)格的界線，通常將分子量在6000道爾頓以上的多肽稱為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量變化范圍很大,從大約6000到1000000道爾頓甚至更大。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有不同的層次，人為地分為1－4級結(jié)構(gòu)。一、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次的劃分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的主要層次一級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)primarystructuresecondarystructureTertiarystructurequariernarystructure超二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域

supersecondarystructureStructuredoman蛋白質(zhì)不同結(jié)構(gòu)層次的相互關(guān)系二、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)

定義：蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（Primarystructure）又稱為共價結(jié)構(gòu)或化學(xué)結(jié)構(gòu)。1969年，國際純化學(xué)與應(yīng)用化學(xué)委員會（IUPAC）規(guī)定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽鏈中AA的排列順序，包括二硫鍵的位置。

是蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)，其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)，它包含著決定蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)和生物功能的信息。牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)

結(jié)構(gòu)：1、由51個AA組成，分子量5734。2、由A、B兩條鏈組成，A鏈21個AA,B鏈30個AA。3、兩鏈間有兩對二硫鍵（7－7）（20－19）A鏈具有鏈內(nèi)環(huán)（6－11）。

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)研究

一級結(jié)構(gòu)的研究包括：蛋白質(zhì)的氨基酸組成測定，肽鏈數(shù)目的確定，末端氨基酸種類測定，氨基酸的排列順序測定，二硫鍵位置的測定，酰胺位置的確定。大致步驟如下：1.獲取一定量純的蛋白質(zhì)樣品，測其分子量，然后將樣品完全水解，確定該蛋白質(zhì)的氨基酸種類、數(shù)目及每種氨基酸的含量。2.進(jìn)行末端測定，確定該蛋白質(zhì)的肽鏈數(shù)目，N-端和C-端是什么氨基酸。

N-末端測定法：常采用2，4—二硝基氟苯法、Edman降解法、丹磺酰氯法。

C-末端測定法：常采用肼解法、羧肽酶法。3.肽鏈的拆分:經(jīng)末端的分析，若該蛋白質(zhì)含有兩條以上的肽鏈，而且肽鏈之間是通過非共價鍵連接，使用蛋白質(zhì)變性劑將其變性后分開；若蛋白質(zhì)肽鏈之間通過共價鍵相連，則可采取過甲酸氧化法或巰基乙醇還原法將其分開。4.各肽鏈中氨基酸排列順序的測定:使用兩種以上的方法將肽鏈部分水解成肽段，測各肽段的氨基酸順序，然后使用片段重疊法推測出完整肽鏈的氨基酸順序。5.確定二硫鍵和酰胺的位置

將肽段順序進(jìn)行疊聯(lián)以確定完整的順序?qū)㈦亩畏蛛x并測出順序?qū)Ｒ恍粤呀饽┒税被釡y定二硫鍵拆開純蛋白質(zhì)

定義：

稱為蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)或構(gòu)象，是以一級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)分子中原子或基團(tuán)在三維空間上的排列、分布和走向。包括2－4級結(jié)構(gòu)。

三、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一、二、三、四級結(jié)構(gòu)構(gòu)型：是指在立體異構(gòu)體之間，原子或基團(tuán)在空間的取向（不同排布方式）。特點：是一種二維變化；構(gòu)型之間的相互轉(zhuǎn)變涉及到共價鍵的形成與破壞，與氫鍵無關(guān)。構(gòu)象：是表示一個分子結(jié)構(gòu)中（多肽）各原子或基團(tuán)之間相互立體關(guān)系（一切原子或基團(tuán)沿共價鍵轉(zhuǎn)動而產(chǎn)生的不同空間排列）。特點：是一種三維空間的變化；構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)變是通過鍵的旋轉(zhuǎn)或扭曲來完成的，涉及到氫鍵等次級鍵的形成和破壞。但不改變共價鍵。

構(gòu)型與構(gòu)象

共價鍵

a.鹽鍵b.氫鍵c.疏水鍵d.范得華力e.二硫鍵維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的作用力肽鍵二硫鍵鹽鍵氫鍵疏水鍵非共價鍵范德華力定義：指多肽鏈在一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，按照一定的方式有規(guī)律的折疊和盤繞形成的特定空間構(gòu)象。其實質(zhì)是多肽鏈在空間的排列方式。特點：只涉及肽鏈主鏈的構(gòu)象及鏈內(nèi)或鏈間形成的氫鍵，氫鍵是穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)的主要作用力。類型：天然蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)一般有-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角、自由回轉(zhuǎn)四、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)特征：1、每隔3.6個AA殘基螺旋上升一圈，螺距0.54nm;2、螺旋體中所有氨基酸殘基R側(cè)鏈都伸向外側(cè)，鏈中的全部>C=0和>N-H幾乎都平行于螺旋軸;3、每個氨基酸殘基的>N-H與前面第四個氨基酸殘基的>C=0形成氫鍵，肽鏈上所有的肽鍵都參與氫鍵的形成。4、在多肽鏈內(nèi)形成氫鍵。5、α-螺旋在許多蛋白中