無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)聯(lián)合血清學(xué)產(chǎn)前篩查在產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體中的應(yīng)用

無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)聯(lián)合血清學(xué)產(chǎn)前篩查在產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體中的應(yīng)用

中國是一個(gè)出生缺陷嚴(yán)重的國家。每年新增出生缺陷120萬，每年約占人口的4.6%。21號(hào)和13號(hào)染色體綜合征是人類最常見的三種染色體疾病。孩子的臉很特殊。大多數(shù)兒童患有嚴(yán)重的精神障礙和器官畸形，這對(duì)家庭和社會(huì)有重大影響和負(fù)擔(dān)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)胎兒染色體疾病尚無有效的治療方法,最好的方法是在孕期通過產(chǎn)前篩查及診斷,發(fā)現(xiàn)異常并及時(shí)采取相應(yīng)措施。但是臨床常用的產(chǎn)前篩查方法存在較高的假陽性率和漏檢率,而介入產(chǎn)前診斷雖準(zhǔn)確率高,卻可能導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)感染和流產(chǎn),難以被廣大孕婦和家庭所接受。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷應(yīng)運(yùn)而生。本研究通過對(duì)792例血清學(xué)篩查高危孕婦,采用無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)的方法進(jìn)一步篩查,顯著降低了假陽性率和漏檢率。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1對(duì)象和方法1.1血清學(xué)篩查結(jié)果2013年5月-2013年12月,我院對(duì)14098例孕婦進(jìn)行了血清學(xué)篩查,結(jié)果為21-三體和(或)18-三體的單胎孕婦有792例,孕周均在12-26w,知情同意后,全部進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)。1.2方法1.2.1互通日期篩查孕婦清晨空腹時(shí)采集靜脈血3ml,使用一次性無抗凝劑真空采血管,8小時(shí)內(nèi)盡快處理分離血清,血清在4℃下可保存一周,-20℃下可保存一個(gè)月。采用時(shí)間分辨熒光檢測(cè)法,確定孕婦的出生年月、孕周(14-21w)、體重、民族、既往病史等參數(shù),將其輸入篩查檢測(cè)軟件,進(jìn)行產(chǎn)前篩查。本實(shí)驗(yàn)室21-三體篩查風(fēng)險(xiǎn)切割值(cut-off值)為1/270,篩查風(fēng)險(xiǎn)≥1/270判斷為21-三體篩查高風(fēng)險(xiǎn),18-三體綜合征風(fēng)險(xiǎn)切割值為1/350,篩查風(fēng)險(xiǎn)≥1/350,判斷為18-三體綜合征高風(fēng)險(xiǎn),反之判斷為18-三體綜合征低風(fēng)險(xiǎn)。1.2.2離心血漿分離無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)主要包括血漿分離、DNA提取、文庫構(gòu)建、cBot成簇反應(yīng)、測(cè)序及數(shù)據(jù)分析等過程。知情同意后,采用EDTA-K2抗凝管抽取孕婦外周血5ml,4℃冰箱保存,并于8小時(shí)內(nèi)進(jìn)行血漿分離,4℃以1600g離心10min,將上清液分裝到2個(gè)2ml離心管中,4℃以16000g再次離心10min,所得上清液轉(zhuǎn)入4個(gè)新的已編號(hào)的2ml離心管中,每個(gè)離心管轉(zhuǎn)入600μl血漿,血漿樣本總量不少于2ml,同時(shí)貼上相應(yīng)的條形碼。分離后的血漿在-20℃冰箱中可保存3天,長(zhǎng)期保存需存放于-80℃冰箱。采用TIANampMicroDNAKit提取血漿DNA,以BGI-ShenzhenNIFTYLibraryConstructionKit試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,cBot成簇反應(yīng)后,采用Illumina公司的Hiseq2000測(cè)序儀進(jìn)行全基因組測(cè)序,利用BGI-ShenzhenNIFTY軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)算胎兒患病風(fēng)險(xiǎn)。1.2.3核分析中的染色體類型無創(chuàng)高危孕婦采用B超介導(dǎo)下經(jīng)腹穿刺術(shù)獲得絨毛、羊水或臍血等標(biāo)本,通過細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶染色體核型分析,進(jìn)行產(chǎn)前診斷。2險(xiǎn)孕產(chǎn)婦染色體核型的發(fā)現(xiàn)792例生化血清學(xué)篩查高危的孕婦進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷,檢出高風(fēng)險(xiǎn)14例,高危檢出率為1.77%,其中6例21-三體,3例18-三體,5例性染色體異常。14例高風(fēng)險(xiǎn)孕婦通過穿刺取樣進(jìn)行染色體核型確診,結(jié)果顯示,5例確診為21-三體,另外1例21-三體孕婦因孕婦胎盤前置,產(chǎn)前介入診斷禁忌,時(shí)孕周28周,孕婦堅(jiān)持足月分娩,采集出生后嬰兒外周血進(jìn)行核型分析,確診為21-三體;3例18-三體均經(jīng)核型確診。因此,無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷對(duì)21-三體及18-三體的檢測(cè)準(zhǔn)確率為100%。但5例性染色體異常只有1例確診為47,XXY,與無創(chuàng)產(chǎn)前結(jié)果一致,其余4例的核型結(jié)果顯示無結(jié)構(gòu)及數(shù)目異常。對(duì)778例無創(chuàng)檢測(cè)陰性的孕婦進(jìn)行隨訪,目前未發(fā)現(xiàn)染色體非整倍體異常的患兒。3無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)目前染色體病尚無有效治療方法,唯一有效的措施為廣泛開展產(chǎn)前篩查與診斷,傳統(tǒng)的臨床篩查是通過血清學(xué)生化篩查,而目前通用母體血清學(xué)篩查由于缺乏中國孕婦人群各項(xiàng)篩查指標(biāo)的正常值范圍,從而無法確定產(chǎn)前篩查的高危切割值。另外,母體血清產(chǎn)前篩查各指標(biāo)的檢測(cè)方法中,酶免法(ELISA)最為常用,但采用該法進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí),易受很多因素影響,結(jié)果變異較大,導(dǎo)致各個(gè)醫(yī)療單位所采用的診斷指標(biāo)差異很大,其靈敏性和特異性欠佳,假陽性率較高,嚴(yán)重影響了國內(nèi)中孕期產(chǎn)前篩查的準(zhǔn)確率。目前,傳統(tǒng)的產(chǎn)前基因診斷方法雖然為產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但該方法主要通過絨毛活檢、羊膜腔及臍靜脈穿刺術(shù)獲取胎兒遺傳物質(zhì),對(duì)于孕婦及胎兒均具有一定的創(chuàng)傷,容易導(dǎo)致宮內(nèi)感染,同時(shí)可導(dǎo)致0.5%~3%的流產(chǎn)率。1997年,Lo等在孕婦外周血中發(fā)現(xiàn)有胎兒游離DNA,為無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷技術(shù)的開展提供了理論依據(jù)。高通量測(cè)序技術(shù)的興起,使無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷技術(shù)由理論變成了現(xiàn)實(shí)。而且胎兒游離DNA在分娩后短時(shí)間內(nèi)將消失,平均半衰期為16.3min,2h后就無法檢出,因此,該技術(shù)對(duì)再次妊娠時(shí)的檢測(cè)結(jié)果沒有任何影響。2010年,Lun等運(yùn)用大規(guī)模并行基因組測(cè)序法成功檢測(cè)出1例易位型21-三體。2011年,Chiu等應(yīng)用無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)753例21-三體高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦外周血,其中86例胎兒為21-三體高風(fēng)險(xiǎn),與染色體核型進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)21-三體胎兒的檢出率為100%。本研究對(duì)792例生化血清學(xué)高危孕婦外周血進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前基因組測(cè)序檢測(cè),檢出6例21-三體綜合征,3例18-三體綜合征,檢出率均為100%。但性染色體檢測(cè)穩(wěn)定性欠佳,有研究認(rèn)為是由于GC含量的干擾所致,JiangF等以標(biāo)準(zhǔn)Z-Score值為基礎(chǔ),通過改進(jìn)染色體內(nèi)標(biāo)參照及計(jì)算方式,一定程度上降低了GC含量的影響,實(shí)現(xiàn)結(jié)果值變異系數(shù)小,提高和穩(wěn)定了18,13-三體及性染色體檢出率。因此采用無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行胎兒染色體異常篩查,符合臨床檢測(cè)要求,具有臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。相較于血清學(xué)篩查,無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)技術(shù)覆蓋面廣(血清學(xué)篩查無法檢測(cè)13號(hào)染色體及性染色體變異),同時(shí)還具有準(zhǔn)確性高、無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn),尤其適用于試管嬰兒。此外,該技術(shù)還擁有良好的可擴(kuò)展性,除染色體非整倍體外,將來還可能應(yīng)用于胎兒染色體微缺失和微重復(fù)、單基因病、甚至全基因組的檢測(cè)。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步和測(cè)序成本的不斷下降,基于全基因組測(cè)序的檢測(cè)技術(shù)擁有非常廣闊的發(fā)展空間,將向更加快速化、早期化和個(gè)性化邁進(jìn)。本研究采用無創(chuàng)產(chǎn)前基