第十三章：基因工程的操作過程

第十三章基因工程的操作過程基因工程操作的基本過程目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的檢測與鑒定目的基因，即準備要分離、改造、擴增或表達的基因。一、目的基因的獲取已知基因的獲得目前目的基因的獲取方法主要有以下2類：PCR分離法化學合成法未知基因的獲得直接分離法基因文庫分離法已知基因的獲得如果知道目的基因的全序列或其兩端的序列，通過合成一對與序列互補的引物，就可以十分有效的擴增出所需的目的基因。模板可以是基因組DNA，也可以是mRNA序列，或是已克隆到某一載體上的基因片段。PCR分離法采用PCR分離目的基因省時、省力，但他一般要求待擴增的片段是已知的，至少要求DNA片段兩端長約20bp的序列已知的，這樣才能設(shè)計出有效的引物。PCR擴增的片段需要進行測序以便進一步驗證擴增片段是否為目的基因?；瘜W合成法對于基因比較小，核苷酸序列已知，也可以通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。磷酸二酯法磷酸三酯法固相亞磷酸三酯法未知基因的獲得直接分離法限制性內(nèi)切酶法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。應用對象：適合于從簡單的基因組中分離目的基因，如質(zhì)?；虿《镜拇笮≈挥袔浊A基，大的也超不過幾十萬堿基，編碼基因比較少，獲得也比較簡單。對已定序列的DNA分子，只需要用已知識別序列的限制性內(nèi)切酶進行一次或幾次切割，分離純化所需要的DNA片斷，與適當載體連接。對已知定位的目的基因，只要根據(jù)目的基因兩側(cè)的已知的酶切識別位點，一次就可以獲得。即使含目的基因的DNA分子未定序或定位，也只須通過酶切分析，隨后再通過部分酶切，構(gòu)建一個簡單的基因文庫，從中調(diào)出目的基因。隨機片斷化限制性內(nèi)切酶局部消化法機械切割法超聲波---可使其斷裂成約300bp的隨機片斷高速攪拌---1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機片斷基本原理：DNA分子的兩條鏈存在著G≡C、A＝T堿基配對，其中GC間存在3個氫鍵、AT間存在2個氫鍵，如果不同基因片段的堿基組成差異較大，其理化性質(zhì)，如浮力密度和解鏈溫度等也明顯不同，采用相應的方法即可達到從生物基因組中分離目的基因的目的。物理化學法密度梯度離心法---由于富含堿基GC的雙鏈DNA片段浮力密度較大，利用精密的密度梯度超速離心技術(shù)可使切割成適當片段的不同DNA按密度大小分離開來。然后通過與某種放射性的mRNA雜交來檢驗，分離相應的基因。非洲爪瞻5SDNA和海膽組蛋白基因就是根據(jù)此分離得到。單鏈酶解法---DNA分子中某基因片段GC堿基含量高，則其熱穩(wěn)定性高，即其解鏈溫度（Tm）值就高。據(jù)此，可以通過控制解鏈溫度使富A=T區(qū)變性解鏈，而富G≡C區(qū)的DNA的片段仍為雙鏈。海膽rDNA分子內(nèi)GC含量可高達63%，通過熱變性和S1酶解處理可得到提純50倍的rDNA。分子雜交法---單鏈DNA與其互補的序列總有“配對成雙”的傾向，這是分子雜交的原理。1969年，美國哈佛大學Beckwith等應用DNA-DNA分子雜交，成功分離了β-半乳糖苷酶基因。基因文庫分離法基因組文庫（genelibrary）是指某一生物類型全部基因的集合。這種集合是以重組體形式出現(xiàn)。某生物DNA片段群體與載體分子重組，重組后轉(zhuǎn)化宿主細胞，轉(zhuǎn)化細胞在選擇培養(yǎng)基上生長出的單個菌落（或噬菌斑）（或成活細胞）即為一個DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合體即為該生物的基因文庫?；蚪M文庫使生物的遺傳信息以穩(wěn)定的重組體形式貯存起來是分離克隆目的基因的主要途徑復雜基因組作圖的重要依據(jù)構(gòu)建基因組文庫的意義：細胞染色體大分子DNA的提取和大片段的制備；載體DNA的制備；載體與外源大片段連接；體外包裝及基因組DNA文庫的擴增；重組DNA的篩選和鑒定。基因組文庫構(gòu)建的一般步驟：N：克隆數(shù)目P：設(shè)定的概率值（如：0.99）x：插入片段平均大?。?5～20kb）y：植物基因組大?。ㄒ詋b計）基因組文庫的大小一個文庫要包含99%的基因組DNA時所需要的克隆數(shù)目。如果插入片段平均大小為20kb某植物基因組大小為4x106bp，P=0.99時，根據(jù)上式N≈1×105。含1×105個克隆的基因文庫相當覆蓋了500倍的基因組，在片段隨機分布時，從文庫中找到任一序列的概率不低于0.99。cDNA文庫利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細菌細胞中進行保存和擴增。不含內(nèi)含子序列?？梢栽诩毦兄苯颖磉_。包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。比DNA文庫小的多，容易構(gòu)建。cDNA文庫的特點細胞總RNA提取并分離純化出mRNA；合成cDNA第一鏈；將mRNA－DNA雜交分子轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA；雙鏈cDNA重組到載體上。前3步為cDNA合成，第④步為cDNA克隆。cDNA文庫的構(gòu)建cDNA文庫的大小一個cDNA文庫要包含99%的mRNA所需要的克隆數(shù)目。N：克隆數(shù)目P：文庫包含了完整mRNA的概率（99%）1/n：某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細胞整個mRNA的比例篩選文庫中目的克隆最常用的方法是探針雜交法。利用同源探針篩選目的克隆二、基因表達載體的構(gòu)建用一定的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出黏性末端；用同一種限制性內(nèi)切酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端；將切下的目的基因片段和質(zhì)粒用DNA連接酶連接，形成一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。vector構(gòu)建基因表達載體的目的是使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。因此，一個基因表達載體的組成，除了目的基因外，還必須有啟動子、終止子和標記基因等。三、將目的基因?qū)胧荏w細胞將目的基因?qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物的受傷部位(受傷處的細胞會分泌大量酚類化合物，從而使農(nóng)桿菌移向這些細胞)，并誘導產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）是一種能誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤的細菌，根癌農(nóng)桿菌中誘導植物產(chǎn)生腫瘤的質(zhì)粒（Tumorinducingplasmid），簡稱為Ti質(zhì)粒。農(nóng)桿菌介導法植物轉(zhuǎn)基因的理論基礎(chǔ)野生型農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，含有兩個與致瘤有關(guān)的區(qū)域：一個是T－DNA區(qū)（transferredDNAregion），含致瘤基因；另一個是毒性區(qū)（Virulenceregion）。用于植物基因轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)的構(gòu)建，是將野生Ti質(zhì)粒中的致瘤基因刪除，并在T-DNA區(qū)域內(nèi)插入適當?shù)倪x擇標記和多克隆位點。農(nóng)桿菌介導法：就是將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。基因槍法粒子轟擊(particlebombardment)高速粒子噴射技術(shù)(High-velocityparticlemicroprojection)基因槍轟擊技術(shù)(genegunbombardment)，是通過動力系統(tǒng)將帶有基因的金屬顆粒（金?；蜴u粒），將DNA吸附在表面，以一定的速度射進植物細胞，由于小顆粒穿透力強，故不需除去細胞壁和細胞膜而進入基因組，從而實現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的目的?；驹硭哂袘妹鎻V，方法簡單，轉(zhuǎn)化時間短，轉(zhuǎn)化頻率高，實驗費用低等優(yōu)點。對于農(nóng)桿菌不能感染的植物，采用該方法可打破載體法的局限。花粉管通道法是指在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個體。通過花粉管通道途徑滲透進入胚囊的轉(zhuǎn)基因片段就有可能被吸入受精卵細胞，并進一步地通過尚不明確的機理被整合進入受體基因組中。

優(yōu)點：不依賴于植物組織培養(yǎng)和誘導再生植株等一整套人工培養(yǎng)過程。應用于任何開花植物，極大地擴大了基因工程目的基因的來源，和受體植物的范圍。

利用整體植株的卵細胞、受精卵或早期胚細胞進行轉(zhuǎn)化，直接獲得的產(chǎn)品即是轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)化速度較快，轉(zhuǎn)化效率可達1%左右，一般當年即可獲得轉(zhuǎn)基因植株。方法簡便有效，易于常規(guī)育種工作者掌握，適合于大規(guī)模的農(nóng)作物遺傳化。缺點：工作時間受自然花期限制。在自然田間進行操作，受環(huán)境條件的影響很大。由于轉(zhuǎn)基因以隨機的方式整合進入受體染色體基因組中，轉(zhuǎn)基因工程植株的后代的遺傳情況較為復雜。操作的經(jīng)驗性很強，需要一定的技術(shù)摸索和技巧。對單籽粒的小花農(nóng)