第七章 紫外-可見分光光度法

案例導(dǎo)入

在夏天參加戶外活動時，如果天氣晴朗，就應(yīng)該注意保護(hù)皮膚，否則，暴露在火辣辣太陽之下的皮膚，數(shù)小時后就會出現(xiàn)紅腫、瘙癢、發(fā)熱、刺痛癥狀，數(shù)日后出現(xiàn)蛻皮現(xiàn)象，這表明太陽光中有一種光線能傷害生物細(xì)胞?？茖W(xué)家研究證實，這種光線是紫外線。

根據(jù)可見光、紫外光與物質(zhì)分子的相互作用建立了紫外-可見分光光度法，

第一節(jié)概述一、物質(zhì)對光的選擇性吸收單色光:

單一波長的光束復(fù)合光:

含有多種波長的光束電磁波譜:

以波長大小順序排列的電磁波譜圖波長10pm300pm200nm400nm800nm500mm1cm1m光譜射線X射線紫外光可見光紅外光微波無線電波方法

光譜法分光光度法光譜法核磁共振可見光第一節(jié)概述紅光與綠光互補(bǔ)、紫光與黃光互補(bǔ)，等等。

白光的組成白光的色散第一節(jié)概述二、透光率與吸光度I0＝Ia+It

第一節(jié)概述透射光強(qiáng)度It與入射光強(qiáng)度I0的比值稱為透光率或透光度T透光率的負(fù)對數(shù)為吸光度A

第一節(jié)概述三、吸收光譜曲線概念：以波長λ為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)所描繪的曲線，稱為吸收光譜曲線，簡稱吸收光譜。特點(diǎn)：在相同條件下，同一物質(zhì)的不同濃度的溶液，其吸收光譜曲線相似，且λmax相同。這是定性分析的基礎(chǔ)。第一節(jié)概述吸收光譜曲線示意圖

A480520560nm

max=515第一節(jié)概述四、紫外-可見分光光度的特點(diǎn)特點(diǎn)靈敏度高準(zhǔn)確度高精密度好選擇性好易于普及應(yīng)用廣泛儀器簡單操作簡便價格低廉測定快速課堂活動1．紫外-可見光的波長范圍是

A．200~400nmB．400~760nmC．200~760nmD．360~800nm2．下列敘述錯誤的是A．光的能量與其波長成反比B．有色溶液越濃，對光的吸收也越強(qiáng)烈C．物質(zhì)對光的吸收有選擇性D．光的能量與其頻率成反比第一節(jié)概述課堂活動3．紫外-可見分光光度法屬于A．原子發(fā)射光譜法B．原子吸收光譜法C．分子發(fā)射光譜法D．分子吸收光譜法4．分子吸收可見-紫外光后，可發(fā)生哪種類型的分子能級躍遷A．轉(zhuǎn)動能級躍遷B．振動能級躍遷C．電子能級躍遷D．以上都能發(fā)生

第一節(jié)概述第一節(jié)概述點(diǎn)滴積累1．光的本質(zhì)是電磁波；物質(zhì)對光的吸收具有選擇性。2．吸光度與透光率的關(guān)系是:3．吸收曲線是溶液在一定條件下的吸光度隨入射光波長變化而變化的曲線。

第二節(jié)紫外-可見分光光度法的基本原理一、光的吸收定律

當(dāng)一束平行的單色光通過均勻、無散射的含有吸光性物質(zhì)的溶液時，在入射光的波長、強(qiáng)度及溶液的溫度等條件不變的情況下，該溶液的吸光度A與溶液的濃度c及液層厚度L的乘積成正比，即：A＝K·L·c。稱為光的吸收定律（朗伯-比爾定律）。光的吸收定律是定量分析的理論依據(jù)。第二節(jié)紫外-可見分光光度法的基本原理朗伯-比爾定律不僅適用于可見光，而且也適用于紫外光和紅外光；不僅適用于均勻、無散射的溶液，而且也適用于均勻、無散射的固體和氣體。實驗證明：溶液對光的吸光度具有加和性。如果溶液中同時存在兩種或兩種以上的吸光性物質(zhì)，則測得的該溶液的吸光度等于溶液中各吸光性物質(zhì)吸光度的總和，即：

A（a+b+c）＝Aa＋Ab＋Ac

第二節(jié)紫外-可見分光光度法的基本原理第二節(jié)紫外-可見分光光度法的基本原理二、吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)：在入射光波長一定時，溶液濃度為1mol/L，液層厚度為1cm時所測得的吸光度稱為摩爾吸光系數(shù)，常用ε表示。光吸收系數(shù)在入射光波長一定時，溶液濃度為1g/L，液層厚度為1cm時的吸光度，稱為光吸收系數(shù)，常用表示，其量綱為L/(g·cm)。

第二節(jié)紫外-可見分光光度法的基本原理百分吸光系數(shù)：在入射光波長一定時，溶液濃度為1﹪（W/V）、層厚度為1cm時所測得的吸光度稱為百分吸光系數(shù)，常用表示。

二者的關(guān)系：

課堂活動用雙硫腙測定Cd2+溶液的吸光度A時，Cd2+（Cd的原子量為112）的濃度為140μg/L，在λ＝525nm波長處，用L＝1cm的吸收池，測得吸光度A＝0.220，試計算摩爾吸光系數(shù)和百分吸收系數(shù)。

第二節(jié)紫外-可見分光光度法的基本原理課堂互動某有色溶液的物質(zhì)的量濃度濃度為c，在一定條件下用1cm比色杯測得吸光度為A，則摩爾吸光系數(shù)應(yīng)為：A．cAB．cMC．A/CD．C/A第二節(jié)紫外-可見分光光度法的基本原理第二節(jié)紫外-可見分光光度法的基本原理三、偏離光的吸收定律的主要因素化學(xué)因素:(1)溶液的濃度(2)物質(zhì)的化學(xué)變化(3)溶劑的影響光學(xué)因素:(1)非單色光

(2)雜散光

(3)非平行光(4)反射現(xiàn)象

(5)散射現(xiàn)象第二節(jié)紫外-可見分光光度法的基本原理偏離光的吸收定律示意圖第二節(jié)紫外-可見分光光度法的基本原理點(diǎn)滴積累1．光的吸收定律表明了吸光度與液層厚度和濃度之間的關(guān)系，它是吸收光譜法定量分析的依據(jù)。2．吸光系數(shù)的表示方法有多種，隨待測溶液濃度的不同標(biāo)度而不同。3．偏離光的吸收定律的因素主要有化學(xué)因素和光學(xué)因素。一、紫外-可見分光光度計的主要部件：光源—單色器—吸收池—檢測器—訊號處理與顯示器

第三節(jié)紫外-可見分光光度計第三節(jié)紫外-可見分光光度計

二、紫外-可見分光光度計的光學(xué)性能1．測光方式2．波長范圍3．狹縫或光譜帶寬4．雜散光5．波長準(zhǔn)確度6．吸光度范圍7．波長重復(fù)性8．測光準(zhǔn)確度9．光度重復(fù)性10．分辨率

第三節(jié)紫外-可見分光光度計三、紫外-可見分光光度計的類型1.可見分光光度計721型

第三節(jié)紫外-可見分光光度計三、紫外-可見分光光度計的類型1.可見分光光度計

722型第三節(jié)紫外-可見分光光度計三、紫外-可見分光光度計的類型2.紫外-可見分光光度計（1）單波長分光光度計單光束分光光度計雙光束分光光度計第三節(jié)紫外-可見分光光度計課堂活動1.試述紫外-可見分光光度計的主要部件及其作用？2.紫外-可見分光光度計有哪些類型？第三節(jié)紫外-可見分光光度計第三節(jié)紫外-可見分光光度計點(diǎn)滴積累紫外-可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu)相同，都由光源、單色器、吸收池、檢測器、訊號處理與顯示器等主要部件構(gòu)成，但不同型號儀器的外形差別很大，質(zhì)量和價格相差懸殊，操作方法迥異，使用之前應(yīng)仔細(xì)閱讀儀器使用說明書。

一、儀器測量條件的選擇1.應(yīng)選擇最大吸收波長作為入射光。2.應(yīng)控制吸光度讀數(shù)范圍：吸光度在0.2~0.7之間；透光率在20%~65%之間。第四節(jié)分析條件的選擇第四節(jié)分析條件的選擇二、顯色反應(yīng)條件的選擇1.對顯色劑及顯色反應(yīng)的要求

2.控制合適的顯色反應(yīng)條件

三、參比溶液的選擇1.溶劑參比溶液2.試樣參比溶液3.試劑參比溶液4.平行操作參比溶液第四節(jié)分析條件的選擇課堂活動測定試樣時，吸光度的讀數(shù)應(yīng)控制在0.2～0.7范圍內(nèi)。若吸光度讀數(shù)不在此范圍，可采用哪些方法進(jìn)行調(diào)整?第四節(jié)分析條件的選擇點(diǎn)滴積累1．選擇吸光性物質(zhì)的最大吸收波長作為測定波長。2．使用紫外-可見分光光度計時，讀數(shù)范圍應(yīng)控制在吸光度為0.2～0.7，透光率為65%～

20%之間。3．待測物質(zhì)在紫外-可見光區(qū)無吸收時，應(yīng)加顯色劑。顯色劑不得有干擾，反應(yīng)必須完全。4．一般用溶劑作參比溶液。必要時采用試樣參比溶液、試劑參比溶液或平行操作參比溶液。

一、定性分析方法定性的基本依據(jù)：比較光譜的一致性。未知物和標(biāo)準(zhǔn)品的吸收光譜曲線，對比二者是否一致。

比較吸收光譜的特征數(shù)據(jù)及比值的一致性。二、雜質(zhì)檢查：將藥品光譜與藥品標(biāo)準(zhǔn)光譜相對照，利用雜質(zhì)的特征吸收，可以檢測出微量雜質(zhì)及其含量。第五節(jié)定性定量方法案例分析貝諾酯的定性鑒別中國藥典(2010年版)規(guī)定：貝諾酯加無水乙醇制成每1ml約含7.5μg的溶液，在240nm處有最大吸收，相應(yīng)的百分吸光系數(shù)()應(yīng)為730～760。維生素B12也有三個吸收峰，分別在278nm、361nm、550nm波長處，它們的吸光度比值應(yīng)為：A361nm/A278nm在1.70～1.88之間，A361nm/A550nm在3.15～3.45之間。

第五節(jié)定性定量方法案例分析葡萄糖注射液是臨床上常用的藥品之一。制備時需要高溫滅菌，葡萄糖會轉(zhuǎn)化為5-羥甲基糠醛而引入雜質(zhì)?！吨袊幍洹罚?010年版）規(guī)定葡萄糖注射液在284nm波長處的吸收度不得過0.32，以此控制其雜質(zhì)5-羥甲基糠醛的量。在284nm波長處，葡萄糖無吸收，而雜質(zhì)5-羥甲基糠醛在此波長處有最大吸收，可以通過控制供試品溶液在此波長處的吸收度來控制雜質(zhì)的含量。

第五節(jié)定性定量方法第五節(jié)定性定量方法三、定量分析方法定量分析的依據(jù):A＝K·c·L（光的吸收定律）（一）單組分溶液的定量方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法：是紫外-可見分光光度法中最經(jīng)典的定量方法。

第五節(jié)定性定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法的方法和步驟如下:（1）配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇合適的參比溶液，在相同條件下，以待測組分的最大吸收波長作為入射光，分別測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液對應(yīng)的吸光度。（2）以濃度c為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。第五節(jié)定性定量方法

（3）按照相同的實驗條件和操作程序，用待測溶液配制未知試樣溶液并測定其吸光度A樣，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到與之對應(yīng)的未知試樣溶液的濃度c樣。

如右圖。

第五節(jié)定性定量方法2.標(biāo)準(zhǔn)對比法:在相同的條件下，配制濃度為cs的標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度為cx的試樣溶液，在最大吸收波長處，分別測定二者的吸光度值為As、Ax

，依據(jù)朗伯-比爾定律得：As=csLAx=cxL

則:第五節(jié)定性定量方法3.吸光系數(shù)法:吸光系數(shù)法直接利用朗伯-比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式A＝KcL進(jìn)行計算的定量分析方法。在手冊中查出待測物質(zhì)在最大吸收波長處的吸光系數(shù)或,并在相同條件下測量樣品溶液的吸光度A，則其濃度為：

或第五節(jié)定性定量方法有時也可以將待測樣品溶液的吸光度換算成樣品組分的吸光系數(shù)，計算與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光系數(shù)的比值，求出樣品中待測組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)?；虻谖骞?jié)定性定量方法實例：維生素B12水溶液在=361nm處的百分吸光系數(shù)=207。取維生素B12樣品30.0mg，加純化水溶解，用1L的容量瓶定容。將溶液盛于1cm的吸收池，測得361nm波長處的吸光度A=0.600，試求樣品中維生素B12的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。解：第五節(jié)定性定量方法（二）二元組分溶液的定量方法1.解聯(lián)立方程組法

當(dāng)試樣溶液中各待測組分相互干擾不太嚴(yán)重時，可根據(jù)吸光度具有加和性的特點(diǎn)，在同一試樣溶液中同時測定兩個或兩個以上的待測組分。假設(shè)要測定試樣中有兩個待測組分a和b，如果分別繪制a、b兩個純物質(zhì)的吸收光譜，則有三種情況。

第五節(jié)定性定量方法第五節(jié)定性定量方法（Ⅰ）表明，兩個待測組分在各自的最大吸收波長處，另一組分沒有吸收，可以用測定單組分溶液的方法，分別在λ1和λ2波長處測定組分a、b的吸收度,由光的吸收定律求得ca、cb。測定時兩組分互不干擾。（Ⅱ）表明，在組分a的最大吸收波長λ1處，組分b對組分a的測定無干擾，而在組分b的最大吸收波長λ2處，組分a對組分b的測定有干擾。這時，先在λ1波長處單獨(dú)測量組分a；然后在λ2波長處測量組分a、b的總吸光度，根據(jù)吸光度的加和性，從而可以求出cb。

第五節(jié)定性定量方法（Ⅲ）表明，兩個待測組分彼此相互干擾，此時，在波長λ1和λ2處分別測定試樣溶液的總吸光度及，同時測定a、b純物質(zhì)的吸光系數(shù)、和、，根據(jù)吸光度的加和性，則由聯(lián)立方程組求得ca、cb。

第五節(jié)定性定量方法2.等吸收波長消去法（雙波長分光光度法）當(dāng)試樣中兩個待測組分的相互干擾比較嚴(yán)重時，用解聯(lián)立方程組的方法進(jìn)行定量分析會產(chǎn)生較大的誤差，這時可以用等吸收波長消去法進(jìn)行測定。在試樣中含有兩個待測組分a和b時，若要測定組分b，組分a有干擾，應(yīng)設(shè)法消除組分a的吸收干擾。首先選擇待測組分b的最大吸收波長λ2作為測量波長，然后用作圖的方法選擇參比波長λ1，使組分a在這兩個波長處的吸光度相等。

第五節(jié)定性定量方法試樣溶液在λ2和λ1兩個波長處的吸光度之差，只與待測組分b（a）的濃度成正比，而與干擾組分的濃度無關(guān)。

3.差示分光光度法當(dāng)待測組分含量過高時，吸光度超出了準(zhǔn)確測量的讀數(shù)范圍，可以采用差示分光光度法。具體方法是用一個比試樣溶液濃度稍低的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為參比溶液，將分光光度計調(diào)零（透光率100%），測得的吸光度就是被測試樣溶液試液與參比溶液的吸光度差值（相對吸光度）。根據(jù)光的吸收定律得：△A＝Ax－As＝ΕL(cx－cs)即：待測溶液與參比溶液的吸光度差值與兩溶液的濃度之差成正比。第五節(jié)定性定量方法第五節(jié)定性定量方法課堂活動1.在紫外-可見分光光度法中，影響吸光系數(shù)的因素是A．溶劑的種類和性質(zhì)B．溶液的物質(zhì)量濃度C．物質(zhì)的本性和光的波長D．吸收池大小E．待測物的分子結(jié)構(gòu)2.紫外-可見分光光度法常用的定量分析方法有A．間接滴定法B．標(biāo)準(zhǔn)對比法C．標(biāo)準(zhǔn)曲線法D．直接電位法E．吸光系數(shù)法第五節(jié)定性定量方法課堂互動3．在符合朗伯-比爾定律的條件下，有色物質(zhì)的濃度、最大吸收波長、吸光度三者的關(guān)系是A．增加、增加、增加B．增加、減小、不變C．減小、增加、減小D．減小、不變、減小4．維生素D2的摩爾吸收系數(shù)

264nm=18200。用2.0cm吸收池測定，如果要控制吸光度A在0.699～0.187范圍內(nèi)，應(yīng)使維生素D2溶液的濃度在什么范圍內(nèi)？第五節(jié)定性定量方法點(diǎn)滴積累（1）紫外-可見分光光度法的各種定量方法的優(yōu)缺點(diǎn)：1．標(biāo)準(zhǔn)曲線法的優(yōu)點(diǎn)：測定大批量樣品時，操作簡單、準(zhǔn)確、快速。缺點(diǎn)：不同人處理相同的測量數(shù)據(jù)，得到的結(jié)果不易完全相同。2．標(biāo)準(zhǔn)對比法的優(yōu)點(diǎn)：測量數(shù)據(jù)相同，任何人都能得到完全一致的結(jié)果。缺點(diǎn)：隨機(jī)誤差較大。3．吸光系數(shù)法的優(yōu)點(diǎn)：與標(biāo)準(zhǔn)對比法的優(yōu)點(diǎn)相同。缺點(diǎn)：測定條件不易與文獻(xiàn)完全一致，從而引入誤差。

第五節(jié)定性定量方法點(diǎn)滴積累（2）紫外-可見分光光度法的各種定量方法的優(yōu)缺點(diǎn)：4．解聯(lián)立方程組法的優(yōu)點(diǎn)：可以不經(jīng)分離直接測定二元組分溶液。缺點(diǎn)：在兩個測定波長處，要求兩個組分的吸光系數(shù)有較大的差別。5．等吸收波長消去法的優(yōu)點(diǎn)：可以不經(jīng)分離直接測定二元組分溶液，還適于測定混濁液的測定。缺點(diǎn)：要求干擾組分的吸收光譜中有一個峰或谷。6．差示分光光度法的優(yōu)點(diǎn)：可以直接測定高濃度溶液。缺點(diǎn)：需要用高精密度的儀器。

一、有機(jī)化合物的紫外-可見吸收光譜有機(jī)化合物的紫外-可見吸收光譜主要是由分子中價電子的能級躍遷而產(chǎn)生的。電子的能級躍遷有4個基本類型。第六節(jié)紫外-可見吸收光譜在有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用簡介第六節(jié)紫外-可見吸收光譜在有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用簡介二、根據(jù)紫外-可見吸收光譜推斷官能團(tuán)

三、根據(jù)紫外-可見吸收光譜推斷異構(gòu)體（一）判別順反異構(gòu)體（二）測定某些化合物的互變異構(gòu)現(xiàn)象第六節(jié)紫外-可見吸收光譜在有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用簡介點(diǎn)滴積累1．紫外-可見吸收光譜是化合物的價電子能級躍遷形成的。2．根據(jù)紫外-可見吸收光譜的光譜特征，可以推斷待測化合物的官能團(tuán)、順反異構(gòu)和互變異構(gòu)。

第六節(jié)紫外-可見吸收光譜在有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用簡介一、選擇題（一）單項選擇題1．紫外-可見光的波長范圍是：A.200~400nmB．400~760nmC．200~760nmD．360~800nm2．下列敘述錯誤的是：A．光的能量與其波長成反比B．有色溶液越濃，對光的吸收也越強(qiáng)烈C．物質(zhì)對光的吸收有選擇性D．光的能量與其頻率成反比

【目標(biāo)檢測】第六節(jié)紫外-可見吸收光譜在有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用簡介3．紫外-可見分光光度法屬于：A．原子發(fā)射光譜B．原子吸收光譜C．