第六章 化學(xué)物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用1-2節(jié)

第六章

化學(xué)物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用

Interactionsbetweenchemicalsandproteins

主要內(nèi)容第一節(jié)化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀作用

Precipitationofproteinsbychemicals第二節(jié)化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用

Stabilizationofproteinsbychemicals第三節(jié)化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的共價(jià)修飾作用

Covalentmodificationofproteinside-chaingroupsbychemicals第四節(jié)蛋白質(zhì)光譜探針

Spectroscopicprobeofproteins教學(xué)要求熟練掌握化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀作用、變性作用和穩(wěn)定作用；掌握化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的共價(jià)修飾作用；掌握蛋白質(zhì)吸光光度、熒光等分子光譜探針對(duì)蛋白質(zhì)定量分析。在生物體內(nèi)，蛋白質(zhì)（包括酶）占細(xì)胞干重的70%以上，種類(lèi)繁多，在生命活動(dòng)過(guò)程中起著發(fā)揮各種各樣的作用。隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)和生活質(zhì)量要求的提高，蛋白質(zhì)在食品、醫(yī)藥（生化藥物、臨床檢驗(yàn)、藥物篩選等）、環(huán)保（環(huán)境分析）、農(nóng)業(yè)、日用化工（化妝品）、精細(xì)化工（酶催化合成）等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛。在蛋白質(zhì)體外的應(yīng)用中，一般涉及到分離純化、儲(chǔ)存、含量檢測(cè)等過(guò)程，其中常常發(fā)生化學(xué)物質(zhì)與蛋白質(zhì)非專一性的相互作用，如沉淀作用、變性作用、穩(wěn)定作用以及化學(xué)修飾作用等。

化學(xué)物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用球狀蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要特征絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)折疊成為近乎球狀的結(jié)構(gòu)。球狀蛋白質(zhì)一旦具有三級(jí)結(jié)構(gòu)后，蛋白質(zhì)內(nèi)部變得更為緊密，內(nèi)部的空間約有75％被原子所充滿。這樣的密集程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)在液體中的小分子，可以與一些晶體的情況相比?？梢哉J(rèn)為蛋白質(zhì)是帶有極性外套的油滴，也就是“非極性在內(nèi)，極性在外”。大量蛋白質(zhì)的X射線晶體衍射分析統(tǒng)計(jì)的結(jié)果充分證明了這一規(guī)律。蛋白質(zhì)內(nèi)部主要是一些非極性殘基的側(cè)鏈在分子內(nèi)部約有63％是丙氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸等帶電的殘基，天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸和精氨酸只有4％。約95％的帶電的側(cè)鏈?zhǔn)欠植荚诘鞍踪|(zhì)的表面；約14％的亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸在蛋白質(zhì)分子表面。在蛋白質(zhì)的內(nèi)部也存在極少量的親水殘基，在蛋白質(zhì)分子的表面也常見(jiàn)到一些疏水的殘基。這些“異?！狈植嫉臍埢?，致使肽鏈的局部結(jié)構(gòu)發(fā)生“扭曲”，一些鍵的張角與一般正常的值有所偏離，蛋白質(zhì)中這些局部的構(gòu)象具有相對(duì)偏高的能量，相對(duì)地處于較不穩(wěn)定的狀態(tài)，在外界很小的擾動(dòng)作用下，就能發(fā)生變化。原則上，一些相對(duì)規(guī)則的

-螺旋和

-折疊分布在球狀蛋白的內(nèi)部，而且壓積得很緊密，致使球狀蛋白成為致密的結(jié)構(gòu)；那些連接

-螺旋和

-折疊的規(guī)整性相對(duì)差一些的二級(jí)結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)角和環(huán)狀以及特定的“無(wú)規(guī)”卷曲，則更多地是分布在球狀蛋白的外周。還值得指出的是，在很多蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部還存在著數(shù)量不同的水分子，這些水分子也和一些極性的基因或負(fù)電性的原子形成氫鍵。其中一些水分子也參與了蛋白質(zhì)功能的行使。球狀蛋白的表面并不是非常光滑的，而是具有很多溝渠，多數(shù)球狀蛋白的可及表面的面積約為同樣大小的球的表面積的兩倍。

球狀蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的特征具有高度特異性和高度靈敏性。每種蛋白質(zhì)分子都有特定的高級(jí)結(jié)構(gòu)。這種構(gòu)象的特異性，使它區(qū)別于其它類(lèi)蛋白質(zhì)；但這種高度特異的結(jié)構(gòu)，并非固定不變，在執(zhí)行生物學(xué)功能時(shí)，常常發(fā)生一系列的構(gòu)象變化，表現(xiàn)出高度靈敏性。球狀蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)在生物體內(nèi)，這些構(gòu)象變化，往往是該蛋白質(zhì)分子與配基相互作用引起的，配基包括酶的小分子底物、受體的小分子激素和神經(jīng)介質(zhì)、血紅蛋白的O2等。因此，生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)是處于一種可以相互轉(zhuǎn)變的多種構(gòu)象的平衡態(tài)；球狀蛋白質(zhì)分子表面并不是光滑的，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一些“裂隙”或“洞穴”，在“裂隙”或“洞穴’’的周?chē)３Ｊ鞘杷缘模哼@些“裂隙”或“洞穴”可能是蛋白質(zhì)(酶)的活性部位所在?；瘜W(xué)物質(zhì)的作用與蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象硫氧還蛋白的結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合水親水性殘基疏水性殘基第一節(jié)

化學(xué)物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的沉淀作用

Precipitationofproteinsbychemicals蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質(zhì)溶液具有膠體溶液的典型性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)等。由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過(guò)半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。根據(jù)蛋白質(zhì)的親水膠體性質(zhì)，當(dāng)其環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生沉淀作用。蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。改變?nèi)芤旱臈l件，將影響蛋白質(zhì)的溶解性質(zhì)。在適當(dāng)?shù)臈l件下，蛋白質(zhì)能夠從溶液中沉淀出來(lái)。

沉淀作用的類(lèi)型可逆沉淀不可逆沉淀抗體-抗原沉淀在溫和條件下，通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。蛋白質(zhì)在沉淀過(guò)程中結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒(méi)有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，又稱為非變性沉淀。在強(qiáng)烈沉淀?xiàng)l件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水由于沉淀過(guò)程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，又稱為變性沉淀?？贵w和抗原蛋白通過(guò)相互識(shí)別和結(jié)合而發(fā)生的沉淀現(xiàn)象。這種特殊的沉淀作用是生物體免疫功能的基礎(chǔ)。一、無(wú)機(jī)物沉淀二、沉淀劑的類(lèi)型有機(jī)物沉淀鹽析金屬離子沉淀法等電點(diǎn)沉淀聚合物沉淀蛋白質(zhì)水中的溶解度與其表面性質(zhì)有關(guān)在水溶液中，蛋白質(zhì)分子表面帶有電荷基團(tuán)：天冬氨酸、谷氨酸殘基（含羧基）、組氨酸、精氨酸、賴氨酸殘基（含氨基）；含有疏水基團(tuán)形成區(qū)域：苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、纈氨酸等的側(cè)鏈，在疏水區(qū)域的周?chē)?，水分子呈有序排列?、無(wú)機(jī)物沉淀（1）鹽析牢固結(jié)合水大量溶劑水層當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中逐漸加入無(wú)機(jī)鹽時(shí)，開(kāi)始，蛋白質(zhì)的溶解增大，這是由于蛋白質(zhì)的活度系數(shù)降低的緣故，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。但當(dāng)繼續(xù)加入電解質(zhì)時(shí)，另一種因素起作用，使蛋白質(zhì)的溶解度減小，稱為鹽析。這是由于電解質(zhì)的離子在水中發(fā)生水化，當(dāng)電解質(zhì)的濃度增加時(shí)，水分子就離開(kāi)蛋白質(zhì)的周?chē)┞冻鍪杷畢^(qū)域，疏水區(qū)域間的相互作用，使蛋白質(zhì)聚集而沉淀，疏水區(qū)域越多，就越易產(chǎn)生沉淀。MelanderandHorvath理論分析蛋白質(zhì)的鹽析作用是由于靜電作用引起的鹽溶和疏水作用引起的鹽析這兩種作用相互作用的結(jié)果，鹽析方程表示為lgS=lgS0-KsIS0代表當(dāng)離子強(qiáng)度為零時(shí)的溶解度，S為蛋白質(zhì)在某一離子強(qiáng)度溶液中的溶解度；I為中性鹽的離子強(qiáng)度；Ks為鹽析常數(shù)。對(duì)于蛋白質(zhì)組成相近的蛋白質(zhì)，分子量越大，沉淀所需鹽的量越少蛋白質(zhì)分子不對(duì)稱性越大，越易沉淀。不同種類(lèi)的鹽對(duì)溶解度的影響與Ks值有關(guān)：Ks值較大，該鹽的鹽析效果好。含高價(jià)陰離子的鹽，效果比1價(jià)的鹽好。陰離子的鹽析效果有下列次序：檸檬酸鹽>PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-

但高價(jià)陽(yáng)離子的效果不如低價(jià)陽(yáng)離子，例如硫酸鎂的效果不如硫酸銨。對(duì)于1價(jià)陽(yáng)離子則有下列次序：

NH4+＞K+＞Na+最常用的鹽析劑是硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀或磷酸鈉。但硫酸鈉在40C

以下溶解度較低，因而僅適用于對(duì)熱穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。磷酸鹽在中性范圍內(nèi)實(shí)際上是HPO42-和H2PO4-的混合物，其作用比PO43+差。硫酸銨由于價(jià)廉、溶解度大，且能使蛋白質(zhì)穩(wěn)定,在2-3mol/L(NH4)2SO4中酶可保存幾年。同時(shí)由于鹽的濃度高，可防止蛋白酶和細(xì)菌作用，故是最常用的鹽析劑。硫酸銨的缺點(diǎn)是水解后變酸，在高pH下會(huì)釋放出氨，腐蝕性強(qiáng)；殘留的硫酸銨在食品中雖然量少，也會(huì)影響其味，在醫(yī)療上有毒，因此必須除去。常用的鹽析劑一些高價(jià)金屬離子對(duì)沉淀蛋白質(zhì)很有效。它們可以分為三類(lèi)：第一類(lèi)為Mn2+，F(xiàn)e2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+和Cd2+能和蛋白質(zhì)分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等側(cè)鏈結(jié)合。第二類(lèi)為Ca2+，Ba2+，Mg2+和Pb2+能和蛋白質(zhì)分子表面的羧基結(jié)合，但不和含氮化合物相結(jié)合。第三類(lèi)為Ag+，Hg2+和Pb2+能和蛋白質(zhì)分子表面的巰基相結(jié)合。（2）金屬離子沉淀法在稀溶液中金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)有效強(qiáng)的沉淀能力。處理后殘余的金屬離子可用離子交換樹(shù)脂或螯合劑除去。在這些離子中，應(yīng)用較廣的是Zn2+，Ca2+，Mg2+，Ba2+和Mn2+，而Cu2+，F(xiàn)e2+，Pb2+，Hg2+等較少應(yīng)用，因?yàn)樗鼈儠?huì)使產(chǎn)品損失和引起污染。如Zn2+可用于沉淀?xiàng)U菌肽(作用于第4個(gè)組氨酸殘基上)和胰島素；Ca2+(CaCO3)用于分離乳酸，血清清蛋白等。金屬離子沉淀法的優(yōu)點(diǎn)返回2、等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，在電場(chǎng)中不移動(dòng)。等電點(diǎn)沉淀法的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是很多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在偏酸性范圍內(nèi)，而無(wú)機(jī)酸通常價(jià)較廉，并且某些酸，如磷酸、鹽酸和硫酸的應(yīng)用能為蛋白質(zhì)類(lèi)食品所允許。同時(shí)，?？芍苯舆M(jìn)行其他純化操作，無(wú)需將殘余的酸除去。等電點(diǎn)沉淀法的最主要缺點(diǎn)是酸化時(shí)，易使蛋白質(zhì)失活，這是由于蛋白質(zhì)對(duì)低pH比較敏感。pH對(duì)

-乳球蛋白溶解度的影響

返回3、有機(jī)物沉淀有機(jī)溶劑酚類(lèi)化合物及有機(jī)酸沉淀（1）有機(jī)溶劑利用和水互溶的有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)沉淀的方法很早就用來(lái)純化蛋白質(zhì)。加入有機(jī)溶劑于蛋白質(zhì)溶液中產(chǎn)生多種效應(yīng)，這些效應(yīng)結(jié)合起來(lái)使蛋白質(zhì)沉淀。其中主要效應(yīng)是水活度的降低。當(dāng)有機(jī)溶劑濃度增大時(shí)，水對(duì)蛋白質(zhì)分子表面上荷電基團(tuán)或親水基團(tuán)的水化程度降低，或者說(shuō)溶劑的介電常數(shù)降低，因而靜電吸力增大。在疏水區(qū)域附近有序排列的水分子可以為有機(jī)溶劑所取代，使這些區(qū)域的溶解性增大。但除了疏水性特別強(qiáng)的蛋白質(zhì)外，對(duì)多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，后者影響較小，所以總的效果是導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀。

有機(jī)溶劑容易蒸發(fā)除去，不會(huì)殘留在成品中，因此適用于制備食品蛋白質(zhì)。而且有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，便于離心分離。有機(jī)溶劑沉淀法的缺點(diǎn)是容易使蛋白質(zhì)變性失活，且有機(jī)溶劑易燃、易爆、安全要求較高。一般所選擇的溶劑必須能和水互溶，而和蛋白質(zhì)不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，最常用的溶劑是乙醇和丙酮，加量在20%-50%（V/V））之間。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的溶液pH接近等電點(diǎn)時(shí)，引起沉淀所需加入有機(jī)溶劑的量較少。

有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)缺點(diǎn)（2）酚類(lèi)化合物及有機(jī)酸沉淀當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液pH小于其等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶有正電荷，容易與酚類(lèi)化合物或有機(jī)酸酸根所帶的負(fù)電荷發(fā)生作用生成不溶性鹽而沉淀。這類(lèi)化合物包括鞣酸（又稱單寧）、苦味酸（即2,4,6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水楊酸等。一種多酚類(lèi)化合物的寡聚體，它們的酚羥基可以解離而帶有負(fù)電荷，而且分子中的苯環(huán)、多個(gè)羥基可以與蛋白質(zhì)發(fā)生非共價(jià)相互作用，結(jié)合在蛋白質(zhì)的表面。單寧單寧與蛋白質(zhì)的相互作用模型在蛋白質(zhì)分子之間形成多點(diǎn)交連而成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致聚集而沉淀。4、聚合物沉淀非離子型聚合物沉淀法聚電解質(zhì)沉淀法（1）非離子型聚合物沉淀法許多非離子型聚合物，包括聚乙二醇（PEG）可用來(lái)進(jìn)行選