淺析食品中諾如病毒檢測(cè)技術(shù)研究

淺析食品中諾如病毒檢測(cè)技術(shù)研究【摘要】在最近幾年中，食源性疾病高發(fā)，飲食成為了人們面臨的重要課題。研究表明，在食源性疾病傳播中，病毒有著重要地位。諾如病毒(Norovirus，NoV)是一種杯狀病毒，是導(dǎo)致急性病毒性腸胃炎發(fā)作的重要因素，容易在一些集中的場(chǎng)所爆發(fā)，比如學(xué)校、醫(yī)院、餐館等。在本文中，分析了諾如病毒主要的檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)分析了技術(shù)使用的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，希望給諾如病毒之后的研究帶來(lái)參考?！娟P(guān)鍵詞】食品；諾如病毒；檢測(cè)；技術(shù)一、核酸檢測(cè)（一）RT-qPCR在諾如病毒檢測(cè)中，分子RT-qPCR檢測(cè)是其“金標(biāo)準(zhǔn)”，有著很強(qiáng)的敏感性和特異性，能夠快速檢測(cè)到糞便和其環(huán)境中的諾如病毒核酸，同時(shí)能夠?qū)Σ《据d量進(jìn)行測(cè)定。在測(cè)序PCR產(chǎn)物時(shí)，能夠判斷諾如病毒基因型。過(guò)程：（1）提取病毒RNA：使用德國(guó)QIAGEN公司的QIAampVialRNAMinikit試劑盒，采用柱純化技術(shù)，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，最后以30μL洗脫液洗脫。（2）熒光定量RT-PCR法檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系采用上海之江生物科技有限公司NorwalkVirusRealTimeRT-PCRkit。操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，用MJRe-searchOption2熒光定量PCR分析儀，最后根據(jù)檢測(cè)樣品的RT-PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增曲線在FAM檢測(cè)通道有無(wú)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期或Ct值判定是否陽(yáng)性:1無(wú)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期或Ct值≥37，判為陰性;2有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期且Ct值≤35，判為陽(yáng)性。3有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期且3535，判為陰性。該試劑盒能同時(shí)檢測(cè)GI和GⅡ型，最低度檢測(cè)限103copies/mL。RT-qPCR能夠在單一反應(yīng)內(nèi)放大信號(hào)，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)定量效果。在實(shí)際中，該檢測(cè)方式有著很強(qiáng)的特異性，并且靈敏性高，是當(dāng)前檢測(cè)NoV的“金標(biāo)準(zhǔn)”。這種檢測(cè)方法靈敏度能達(dá)到103DNA拷貝數(shù)/mL，同時(shí)也不會(huì)和其他腸道病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)，分析靈敏度高。RT-qPCR是當(dāng)前使用最為普遍的檢測(cè)方式，其特異性很強(qiáng)、靈敏度高，然而卻難以將致病性以及非致病性諾如病毒顆粒區(qū)分開(kāi)來(lái)，在食品樣品基質(zhì)內(nèi)，有很多分子檢測(cè)抑制劑，同樣會(huì)影響到檢測(cè)的結(jié)果。因此，很多研究將其和其他技術(shù)綜合起來(lái)分析，比如先使用PGM，分離活性病毒粒子，然后再使用RT-qPCR。（二）數(shù)字PCR微滴式數(shù)字PCR在使用中首先微滴化處理樣品，其中產(chǎn)生熒光信號(hào)判讀為1，否則為0，按照陽(yáng)性微滴比例判斷結(jié)果。ddPCR不需要依靠外部曲線標(biāo)準(zhǔn)，突破了Ct值局限，成為了一種可以代替RT-qPCR的方式。同時(shí)，其使用有著很高的靈敏度，不會(huì)被基質(zhì)抑制，能夠精準(zhǔn)檢測(cè)，是十分理想的檢測(cè)方式。在當(dāng)前，更多研究集中在數(shù)字PCR上，在食源性致病微生物檢測(cè)中有著顯著的優(yōu)勢(shì)。然而其設(shè)備十分昂貴，影響著技術(shù)的應(yīng)用，相信在未來(lái)的發(fā)展中，隨著儀器成本的降低，這種檢測(cè)方法能夠得到很好的普及。（三）二代測(cè)序技術(shù)二代測(cè)序（NGS）主要是在基因芯片和PCR上產(chǎn)生的，是DNA測(cè)序的一種，該技術(shù)能夠?qū)NA復(fù)制的流程進(jìn)行記錄，測(cè)序其中新添加堿基包含的特殊標(biāo)記，有著高速、高通量的優(yōu)勢(shì)。一般RT-PCR只可以對(duì)NoVRNA存在進(jìn)行簡(jiǎn)單的檢測(cè)，很難分辨出是感染性或者是非感染性的病毒顆粒。為了防止非感染性病毒顆粒出現(xiàn)假陽(yáng)性的問(wèn)題，要實(shí)施樣品的RNase預(yù)處理。研究表明，NGS技術(shù)的應(yīng)用能夠?qū)鋬鰸{果內(nèi)的致病性病毒進(jìn)行檢測(cè)。二代測(cè)序技術(shù)能夠鑒別分析一些罕見(jiàn)和常見(jiàn)的NoV變異序列，在分型溯源中有著顯著的優(yōu)勢(shì)。另外，該方法要進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化，大大減少其中的干擾序列，要求能夠在高度豐富的核酸條件下更加方便檢測(cè)，比如DNases處理樣品。二、免疫學(xué)檢驗(yàn)免疫學(xué)檢驗(yàn)是使用特異性抗體對(duì)樣本內(nèi)的NoV進(jìn)行檢測(cè)。使用量化或檢測(cè)分析物的不同標(biāo)記方式，又可以劃分成不同的類(lèi)型，在當(dāng)前，主要檢測(cè)諾如病毒的技術(shù)方法包含免疫層析技術(shù)和ELISA。（一）免疫層析技術(shù)免疫層析技術(shù)主要是基于免疫滲濾逐漸發(fā)展形成的新型免疫學(xué)檢測(cè)方式。在樣品中如果有相應(yīng)抗原，就會(huì)和抗體產(chǎn)生特異性反應(yīng)，檢測(cè)線展現(xiàn)出能夠看見(jiàn)的條帶。免疫層析有著很長(zhǎng)的保質(zhì)期，同時(shí)其檢測(cè)時(shí)間短、成本低等等，很多商業(yè)免疫層析試劑盒也得到了廣泛的應(yīng)用。在Kumthip的研究中，對(duì)最新的諾如病毒免疫層析試劑盒進(jìn)行了驗(yàn)證，測(cè)試了其在諾如病毒檢測(cè)中的特異性和敏感性，同時(shí)和RT-PCR技術(shù)做出了對(duì)比。結(jié)果表明，該試劑盒的應(yīng)用有著很強(qiáng)的特異性和靈敏度，同時(shí)和一些胃腸炎病毒不會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)。因?yàn)槊庖邔游黾夹g(shù)的特異性低、靈敏度差，因此其分型NoV的能力不足，多數(shù)應(yīng)用在臨床樣本檢測(cè)中。但可將其與其他技術(shù)聯(lián)合以提高檢測(cè)的靈敏度，從而滿足食品中NoV的檢測(cè)要求。（二）ELISAELISA技術(shù)的應(yīng)用能夠把抗體或抗原結(jié)合在固相載體表面，之后添加酶標(biāo)抗體或抗原，在抗原抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合下，酶催化底物就會(huì)顯色，這就實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的目標(biāo)。ELISA檢測(cè)方式容易操作、檢測(cè)時(shí)間短等等。在臨床中，很多商業(yè)ELISA試劑盒都得到了廣泛的應(yīng)用。比如英國(guó)的DakoCytomation公司研發(fā)了IDEIATM諾如病毒試劑盒，德國(guó)也研發(fā)了該技術(shù)，然而這些試劑盒應(yīng)用中的特異性和靈敏度存在很大差距，同時(shí)可能產(chǎn)生假陽(yáng)性的情況，影響了其推廣和使用。在食品中如果NoV的量少，然而ELISA檢測(cè)的最低濃度是104病毒顆粒/g，這就無(wú)法滿足低濃度的檢測(cè)使用。ELISA和另外一些免疫學(xué)檢測(cè)方法相同，其特異性和靈敏度低，最低的檢測(cè)濃度是104～106個(gè)病毒顆粒/g，無(wú)法滿足食品基質(zhì)內(nèi)的NoV檢測(cè)。在當(dāng)前，一些新技術(shù)層出不窮，這給食品內(nèi)NoV檢測(cè)帶來(lái)很大幫助。在最近的研究中，將近紅外熒光和免疫層析法綜合起來(lái)，設(shè)置了一種便攜式試紙條，能夠檢測(cè)貝類(lèi)中的諾如病毒。當(dāng)前新型的免疫分析方法主要是在納米材料基礎(chǔ)上，可以檢測(cè)黃瓜、雞肉和生菜內(nèi)的諾如病毒。在當(dāng)前，免疫學(xué)技術(shù)和其他技術(shù)的綜合使用顯著提高了檢測(cè)的效率，大大增強(qiáng)了檢測(cè)的靈敏度，能夠更好地符合食品中諾如病毒的檢測(cè)需要，同時(shí)檢測(cè)操作十分方便。三、生物傳感器生物傳感器的應(yīng)用原理是把生物響應(yīng)轉(zhuǎn)變成能夠進(jìn)行測(cè)量的光、電以及物理信號(hào)，包含了理化轉(zhuǎn)換系統(tǒng)和生物刺激性材料識(shí)別元件。按照應(yīng)用信號(hào)轉(zhuǎn)換器的不同，生物傳感器又可以劃分成為光學(xué)、電化學(xué)、半導(dǎo)體生物傳感器和壓電晶體。該設(shè)備使用的靈敏度高、成本低廉、分析快等等，有著很強(qiáng)的集成化和自動(dòng)化，這些也都成為研究的重點(diǎn)。（一）電化學(xué)生物傳感器電化學(xué)生物傳感器是一種將生物識(shí)別轉(zhuǎn)換為電流、電位、阻抗等電信號(hào)的傳感平臺(tái)，具有低成本、高靈敏度的特點(diǎn)。在Baek研究中，使用NoroBP-nonFoul-(FlexL)2多肽作為一種結(jié)合劑，研發(fā)出了電化學(xué)生物傳感器。NoroBP多肽可以和NoV特異性結(jié)合。該多肽包含巰基，能夠生成Au—S共價(jià)鍵把多肽包在電極上，在這種情況下，隨著病毒的增加，電流信號(hào)呈現(xiàn)出遞減趨勢(shì)。電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)的敏感度高，同時(shí)其下限在1.7拷貝數(shù)/mL，有著很高的靈敏度，特別實(shí)在牡蠣樣品中的應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)6.21拷貝數(shù)/mL的檢測(cè)。NoV衣殼蛋白檢測(cè)和諾如病毒樣顆粒都能夠?qū)崿F(xiàn)間接的。Guo等研發(fā)出了一種光電化學(xué)生物傳感器，主要進(jìn)行特異性檢測(cè)。在這個(gè)該傳感器中，電極光電流能夠跟隨NoV的衣殼蛋白濃度出現(xiàn)變化，能夠半小時(shí)內(nèi)使用濃度依賴形式檢測(cè)到2×10-10g/mL的NoV衣殼蛋白。另外，Lee在研究中應(yīng)用了外加磁力，把金/磁性納米顆粒修飾的石墨烯沉積在叉指式鉑電極上作為電傳感通道，之后和GII型NoV抗體偶聯(lián)，成為病毒顆粒傳感平臺(tái)。這個(gè)傳感平臺(tái)的使用能夠?qū)Χ緲宇w粒的變化使用電阻變化形式表現(xiàn)出來(lái)，檢測(cè)限是1.16pg/mL。電化學(xué)生物傳感器有著很高的靈敏蘇，同時(shí)也是新型工具，能夠進(jìn)行快速診斷，增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏性，然而在實(shí)際中，并沒(méi)有進(jìn)行普及和推廣。（二）光學(xué)生物傳感器光學(xué)生物傳感器包含類(lèi)型眾多，同時(shí)需要使用的樣品少，具有無(wú)標(biāo)記的特點(diǎn)，其特異性和靈敏度都很多，可以進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，在諾如病毒檢測(cè)中有著很大的應(yīng)用潛力。在實(shí)際中，局域表面等離子體共振是使用最多的傳感方式，能夠快速響應(yīng)，同時(shí)其衰變長(zhǎng)度短等等，能夠?qū)ξ矬w表面的分析物進(jìn)行高精度檢測(cè)。Heo等應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)研發(fā)了人源NoV的傳感器，主要是由親和肽引導(dǎo)的。親和肽能夠在多價(jià)M13隨機(jī)肽庫(kù)內(nèi)篩選出來(lái)，和NoV產(chǎn)生特異性結(jié)合，在ELISA鑒定后，其和NoV結(jié)合的親和力是納摩爾級(jí)別。NoV衣殼蛋白含量和LSPR信號(hào)中的吸光度呈現(xiàn)正比，同時(shí)其最低檢測(cè)限是0.1ng/mL。然而在實(shí)際的LSPR傳感中，必須要對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行嚴(yán)格的控制，減少非特異性結(jié)合，配體在傳感器表面固定之后，就會(huì)導(dǎo)致天然構(gòu)型產(chǎn)生變化，影響到和分析物之間的結(jié)合。另外，熒光的光學(xué)傳感器也能夠應(yīng)用到食品的諾如病毒檢測(cè)中。除了光學(xué)生物和電化學(xué)的傳感器，另外還有很多生物傳感器也都可以進(jìn)行諾如病毒的檢測(cè)，比如比色型生物傳感器、基于質(zhì)量的生物傳感器（石英晶體微天平和微懸臂梁）、免疫傳感器等。在這些檢測(cè)方法中，生物傳感器的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)最顯著，比如其成本低廉、使用的樣品量很少、有著很高的靈敏度、能夠快速進(jìn)行分析等等，在檢測(cè)食品內(nèi)的諾如病毒方面有著突出的優(yōu)勢(shì)。然而雖然生物傳感器的應(yīng)用有著眾多的優(yōu)勢(shì)，能夠大大提高檢測(cè)靈敏度，然而在實(shí)際中并沒(méi)有推廣和普及，并且使用配體捕獲NoV時(shí)，有時(shí)會(huì)對(duì)配體天然構(gòu)象造成改變，阻礙了其和分析物的結(jié)合，因此必須要在未來(lái)進(jìn)行改進(jìn)。四、結(jié)束語(yǔ)諾如病毒是導(dǎo)致急性胃腸炎的主要病原，因?yàn)槠渖飳W(xué)特性突出，十分容易造成食品污染。檢測(cè)食品內(nèi)的諾如病毒能夠給諾如病毒胃腸炎的防治帶來(lái)基礎(chǔ)和保障。在長(zhǎng)期的研究中，食品諾如病毒檢測(cè)技術(shù)也獲得了很大的發(fā)展，人們對(duì)其基因分型、病學(xué)特征和檢測(cè)診斷等等有了更為全面的認(rèn)識(shí)。然而在當(dāng)前的諾如病毒檢測(cè)技術(shù)中，依然存在很多不足和挑戰(zhàn)，必須要深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】[1]徐蕾蕊，李丹，汪琦，馬丹，魏詠新，魏海燕，趙曉娟，張西萌，曾靜.基于RT-ddPCR技術(shù)的食品中諾如病毒定量檢測(cè)[J].食品科學(xué)，2022，43(20):313-320.[2]廖小艷，陳麗麗，白亞龍.食品中諾如病毒檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2021，37(04):200-206+232.DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2021.04.037.[3]YanzhenHan，JianchangWang，ShuhongZhang，JinfengWang，ChenQin，YanqingHan，XiangdongXu.RapiddetectionofnorovirusgenogroupIIinclinicalandenvironmentalsamplesusingrecombinasepolymeraseamplification[J].AnalyticalBiochemistry，2020，605.[4]ValentinaTerio，PatrizioLorusso，AnnaMottola，CanioBuonavoglia，GiuseppinaTan