高等藥物化學(xué)

DNAMethyltransferases（DNMTs）小組成員：戶彪阮霞趙麗杰王帥2014.11.7主要內(nèi)容研究背景DNMTs分類及其結(jié)構(gòu)DNMTs的功能DNMTs抑制劑的相關(guān)研究●●●●表觀遺傳學(xué)是研究基因的DNA序列不發(fā)生變化的前提下，通過核苷酸或染色體的可逆性修飾使基因表達(dá)可遺傳的變化的遺傳學(xué)分支學(xué)科?！瘛瘛裱芯勘尘敖陙肀碛^遺傳學(xué)成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)，越來越多的研究證明，很多疾病的發(fā)生與表觀遺傳修飾的異常相關(guān)，如哮喘、肝癌、和HMT（histonemethyltransferase）異常引起的多種腫瘤等。因此。人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到表觀遺傳學(xué)的相關(guān)研究在人類許多疾病的防治過程中具有的重要意義。表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機(jī)制主要包括DNA甲基化（DNAmethylation）、組蛋白修飾（histonemodification）、非編碼RNA（noncodingRNA，ncRNA）作用等。DNA甲基化與腫瘤的關(guān)系腫瘤發(fā)生是一個(gè)多步驟、多階段的復(fù)雜過程,包括原癌基因激活和抑癌基因失活。

近來,人們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的總體甲基化水平比正常細(xì)胞低,但是伴有某些CpG島甲基化程度增高。位于正常細(xì)胞表達(dá)基因啟動(dòng)子附近的CpG島通常處于非甲基化狀態(tài)；而在腫瘤細(xì)胞中,這些CpG島變?yōu)榧谆癄顟B(tài),其相關(guān)抑制基因的表達(dá)亦被關(guān)閉。抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平偏高，所以研究DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑，以期能夠產(chǎn)生抗癌效果。DNA甲基化是第一個(gè)被確認(rèn)的表觀遺傳學(xué)修飾，參與調(diào)控基因表達(dá)和細(xì)胞分化的過程。DNA的存在不是孤立的，而是和組蛋白及其它染色體相關(guān)蛋白形成一個(gè)復(fù)合體。在真核細(xì)胞中，DNA以染色體的形式存在，核小體是染色體的基本組成單位，由146bpDNA纏繞在以組蛋白H2A、H2B、H3和H4各兩個(gè)分子為中心的八聚體上組成，每個(gè)核心組蛋白由一個(gè)折疊區(qū)和一個(gè)氨基末端結(jié)構(gòu)域形成，其顯著特征是其氨基末端伸向外圍，易于被甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等共價(jià)修飾。另一類蛋白，組蛋白H1，可與線形DNA結(jié)合以幫助后者形成高級(jí)結(jié)構(gòu)與核小體相連。

一、DNA甲基化DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，在CpG二核苷酸的胞嘧啶分子的5'碳原子上添加一個(gè)甲基基團(tuán)的化學(xué)修飾。DNA的甲基化修飾主要發(fā)生在CpG島（CpGislands,CpGIs），即跨越至少200個(gè)堿基對(duì)，GC含量超過50%的DNA片段，主要位于基因的啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)域

。○○首先DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶與DNA結(jié)合,將目標(biāo)核苷酸反轉(zhuǎn)暴露于DNA雙螺旋之外,并嵌入酶的袋形催化結(jié)構(gòu)域里。與此同時(shí),堿基對(duì)氫鍵斷裂,鄰近堿基間堆積作用缺失。DNA-C5甲基轉(zhuǎn)移酶的活性位點(diǎn)(motifIV)中的保守序列PCQ中的半胱氨酸殘基中的硫醇基對(duì)底物C6位碳進(jìn)行親核作用,并形成共價(jià)鍵激活。由于S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基基團(tuán)結(jié)合于S原子上,分子極不穩(wěn)定,在酶的作用下甲基從SAM轉(zhuǎn)移至被激活的C5,隨著C5位上質(zhì)子的釋放與共價(jià)中間物的轉(zhuǎn)變,最終完成DNA的甲基化修飾過程。●原理二、DNMTs1948年Hotchkiss在牛胸腺內(nèi)觀察到甲基轉(zhuǎn)移酶催化的DNA甲基化;1964年,Gold和Hurwitz等在Escherichiacoli中鑒定出第一個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶?！穹诸怐NA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）催化和維持DNA的甲基化。根據(jù)催化反應(yīng)類型⑴將腺嘌呤轉(zhuǎn)化成N6-甲基腺嘌呤;

（原核生物）⑵將胞嘧啶轉(zhuǎn)化成N4-甲基胞嘧啶;

（原核生物）⑶將胞嘧啶轉(zhuǎn)化成C5-甲基胞嘧啶。（原核生物；真核生物）DNMTsDNMT3aDNMT3LDNMT3b催化DNA復(fù)制過程中的半甲基化CpGs維持甲基化從頭甲基化催化胚胎發(fā)育期甲基化DNMT1調(diào)節(jié)蛋白DNMT2tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶微弱的DNA甲基化酶活性（哺乳動(dòng)物）維持性甲基化酶DNMT1，可在甲基化的DNA模板鏈指導(dǎo)下在對(duì)應(yīng)部位發(fā)生甲基化；二是從頭甲基化酶DNMT3，它必需甲基化的DNA模版，可以使完全非甲基化的DNA完全甲基化修飾。DNMT1(維持甲基化)DNMT3(從頭甲基化)DNMTs的甲基化作用幾乎所有的甲基化胞嘧啶殘基都出現(xiàn)在對(duì)稱序列的5'—GC--3'二核苷酸上1、DNMT1DNMT1是1988年Bestor等從真核生物克隆出來的第一個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶。DNMT1結(jié)構(gòu)183kDaN-末端大結(jié)構(gòu)域C-末端則為催化結(jié)構(gòu)域(CatD),1124~1620aa處⑴帶電結(jié)構(gòu)域(結(jié)合DMP1轉(zhuǎn)錄抑制蛋白)⑵核定位信號(hào)(NLS)⑶PCNA結(jié)合位點(diǎn)⑷復(fù)制叉作用位點(diǎn)⑸鋅離子結(jié)合域CXXC(ZnD)⑹polybromo結(jié)構(gòu)域motifⅠ、Ⅹ折疊一起形成SAM結(jié)合位點(diǎn)motifIV中的PRO-CYS二肽,提供活性位點(diǎn)中的甲醇基包含眾多調(diào)控位點(diǎn),參與細(xì)胞內(nèi)定位及催化活性的調(diào)節(jié)包含6個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶高度保守位點(diǎn),motifⅠ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ等ZnD優(yōu)先識(shí)別甲基化CpG,ZnD與甲基化DNA結(jié)合可以引發(fā)DNMT1催化中心的異構(gòu)激活,從而引起甲基化蔓延。CatD優(yōu)先作用于半甲基化底物DNMT1還存在3個(gè)不同的剪接異構(gòu)體:DNMT1s,DNMT1o和DNMT1p。DNMT1s表達(dá)于體細(xì)胞中,DNMT1p只發(fā)現(xiàn)于粗線期精母細(xì)胞,DNMT1o特異性表達(dá)于卵母細(xì)胞和著床前胚胎中。●●●DNMT1的主要作用是在DNA的復(fù)制和修復(fù)中維持其甲基化，特異性的作用于半甲基化的CpGs二核苷酸。DNA復(fù)制后，DNMT1可識(shí)別半甲基化的CpGs并依照模板鏈的甲基化模式合成新的甲基化DNA。通過這個(gè)過程，DNA的甲基化修飾得以遺傳下來。DNMT1p不具有DNMT1活性,因?yàn)樗牡谝煌怙@子ORF太短,可能干擾了正常翻譯。DNMT1oN-末端缺少118個(gè)氨基酸,但是獲得了更高的穩(wěn)定性,在卵細(xì)胞胞漿能夠長(zhǎng)期存在。當(dāng)胚胎發(fā)育至8細(xì)胞階段時(shí),DNMT1o從胞漿轉(zhuǎn)移至核內(nèi),并在第四次S期復(fù)制中維持印記基因的甲基化。DNMT1s是復(fù)制后維持甲基化的關(guān)鍵酶,沿DNA高速進(jìn)行性甲基化,CGCTC位點(diǎn)趨向終止此過程,它可能是DNMT1作用的終止子,但同時(shí)也是阻遏轉(zhuǎn)錄因子CTCF的結(jié)合位點(diǎn),通過募集CTCF或獨(dú)立途徑能夠阻止DNA甲基化作用向DNA非甲基化區(qū)域蔓延擴(kuò)展。DNMT1構(gòu)象上的變化與活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變有關(guān),能影響近端氨基酸和催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)合,還可能引起Ser515的磷酸化?！瘛瘛馜NMT3a和DNMT3b擁有類似的結(jié)構(gòu):2、DNMT3(1998年)●●半胱氨酸富集的Zn結(jié)合位點(diǎn)(含有多個(gè)Cys、6個(gè)CXXC結(jié)構(gòu))高度可變的N-末端具有催化功能的C末端由于DNMT3a、DNMT3b的DNA結(jié)合位點(diǎn)均較小,大約50個(gè)殘基左右,因此,DNMT3常以二聚體形式存在以增大和底物的接觸面,在一次作用過程中可以同時(shí)甲基化兩個(gè)CpG位點(diǎn)。PWWP(Prolinetryptophantryptophanproline)結(jié)構(gòu)域,其可能與DNA非特異性結(jié)合有關(guān);DNMT3a和DNMT3b的功能主要是針對(duì)未甲基化的CpGs開始重新甲基化（denovomethylation），對(duì)CpG位點(diǎn)的側(cè)翼序列有一定的傾向性。5′-CTTACpGCAAG-3′優(yōu)先被識(shí)別,而對(duì)5′-TGTTCpGGTGG-3′幾乎沒有活性。重新甲基化的過程主要發(fā)生在胚胎干細(xì)胞和癌癥細(xì)胞。DNMT3a對(duì)富含CpG的片段甲基化效率不高,但是其作用更準(zhǔn)確。區(qū)別：DNMT3b能夠甲基化著絲粒遠(yuǎn)端的重復(fù)序列,其間具有高密度的CpG位點(diǎn),它是以進(jìn)行性方式行使甲基化功能的,這種方式有利于短時(shí)間的甲基化。在DNMT3a和DNMT3b缺乏的胚胎干細(xì)胞中,DNMT3L散在分布于核和胞漿內(nèi)。分布在結(jié)構(gòu)上,DNMT3a與DNMT3L形成一個(gè)四聚體,DNMT3a二聚體位于中間位置,DNMT3L二聚體位于外側(cè),兩者通過C-端相接觸。通過C-端的G718-L719-Y720結(jié)構(gòu),DNMT3L能夠穩(wěn)定DNMT3a活性位點(diǎn)的構(gòu)象,包括親核基團(tuán)Cys706。DNMT3a-DNMT3L的結(jié)合提供了一個(gè)穩(wěn)定而廣泛的極性作用,增強(qiáng)了DNMT3a與SAM的結(jié)合。DNMT3a和DNMT3b

存在時(shí)，DNMT3L作為DNA從頭甲基化調(diào)節(jié)因子可以通過與DNMT3a和DNMT3b的C端結(jié)合而轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核內(nèi),可提高它們的催化活性,正向調(diào)節(jié)DNA從頭甲基化。作用：DNMT3L是一種DNMT3類似蛋白,具有半胱氨酸富集的鋅結(jié)合區(qū)域,缺少C端的酶催化活性域,所以沒有單獨(dú)的催化活性。DNMT2存在于胞漿和核內(nèi),細(xì)胞內(nèi)定位顯示大量的DNMT2結(jié)合于核基質(zhì)處,在有絲分裂前期進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),呈現(xiàn)類紡錘體式定位,并在細(xì)胞分裂過程中可觀察到與DNA結(jié)合。3、DNMT2(1998年)結(jié)構(gòu)研究表明：DNMT2序列與原核生物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶高度同源；缺乏N-末端活性結(jié)構(gòu)域,包括391個(gè)氨基酸,大小約為40kDa,含有10個(gè)高度保守DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因序列；在motifⅧ-Ⅸ區(qū)有41個(gè)保守的氨基酸,其中包Cys-Phe-Thr三肽和Asp-Ile二肽,這個(gè)區(qū)域與原核生物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的TRD結(jié)構(gòu)域相一致。在組織內(nèi),DNMT2表達(dá)廣泛,主要存在于肌肉、發(fā)育中的胚胎內(nèi)臟、卵巢囊腫以及增殖中的睪丸細(xì)胞。DNMT2的功能性底物為RNA分子,tRNAAsp是其主要靶標(biāo),它能夠特異性甲基化tRNAAsp反密碼子環(huán)38C，這個(gè)功能具有高度的保守性。人們對(duì)DNMT2功能的認(rèn)識(shí)一直存在爭(zhēng)議。目前研究認(rèn)為它的DNA甲基化酶活性可能非常弱,而且識(shí)別位點(diǎn)并非CpG,因而在體外酶活性實(shí)驗(yàn)中,常常難以觀測(cè)到DNA甲基化酶活性。在果蠅胚胎中的研究證實(shí),DNMT2的作用位點(diǎn)主要是CpT和CpA,其過表達(dá)將導(dǎo)致基因組顯著高甲基化。DNMT2的C79A、E119A、R160A和R162A位點(diǎn)是DNMT2催化活性所必需的,而它們與其他DNMTs相應(yīng)位點(diǎn)具有高度的一致性，所以，認(rèn)為DNMT2和DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的催化機(jī)制極其類似。3、DNMTs家族成員及其結(jié)構(gòu)三、DNMTs的功能1、DNMTs與基因表達(dá)一般認(rèn)為DNA甲基化通過兩種途徑抑制基因表達(dá):直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子與甲基化的CpG島結(jié)合,直接抑制基因表達(dá)；通過招募DNA甲基結(jié)合蛋白(Methyl-CpG-bindingproteins,MBP)及一些阻礙復(fù)合物,阻止轉(zhuǎn)錄因子與特定DNA序列結(jié)合,間接抑制基因表達(dá)。●●DNMT的基因表達(dá)抑制作用與組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑相關(guān)DNMTs與組蛋白修飾相關(guān)因子的相互作用是DNMT調(diào)控基因表達(dá)的重要手段。DNMT1的N端可與HDAC1、HDAC2結(jié)合，DNMT3a、DNMT3b也可招募HDAC，從而使組蛋白去乙酰化；DNMTs還與組蛋白甲基化相關(guān)。DNMT1的N端可以招募組蛋白甲基化酶Suv39h1(Suppressorofvariegation3-9homolog1)和識(shí)別HP1(Heterochromatinprotein1)；Dnmt3a也可與能識(shí)別甲基化組蛋白的HP1和能直接識(shí)別對(duì)稱甲基化組蛋的H4R3me2s(SymmetricmethylationofhistoneH4arginine3)相互作用。DNMT1的N端可以識(shí)別DNA甲基結(jié)合蛋白MBP家族中的MBD1(Methyl-CpGbindingdomain1)、MBD3、MeCP2(Methyl-CpGbindingprotein2)，DNMT通過招募這些蛋白,與組蛋白修飾和染色體重塑共同作用,間接抑制基因表達(dá)。DNMT間接的基因沉默作用還表現(xiàn)在與一些共抑制子的相互作用上。如DNMT3a可以與一種轉(zhuǎn)錄抑制蛋白R(shí)P58結(jié)合,二者共同抑制基因表達(dá)。抑制基因表達(dá)DNMT3b在HeLa細(xì)胞中可以與共抑制子SIN3A(Kinetochoreassociatedprotein)相互作用,同時(shí)也可與驅(qū)動(dòng)蛋白KIF4A(Kinesinfamilymember4A)和凝縮蛋白（condensin）相互作用參與染色質(zhì)濃縮。DNMT與相關(guān)蛋白的相互作用也是DNMT參與組蛋白修飾、染色體變構(gòu)的途徑一些研究表明DNMT與基因沉默相關(guān)因子PcG（Polycombgroup）可相互作用。主要通過PcG蛋白組成的多聚復(fù)合物PRC（Polycombrepressivecomplexes）2和3中的EZH2與DNMT相互作用，共同抑制基因的表達(dá)。最近的一項(xiàng)研究中,小鼠LSD1的編碼基因Aof2被敲除后DNA甲基化水平下降,DNMT1水平下降。組蛋白甲基化酶SET7也可調(diào)控DNMT1的穩(wěn)定性，SET7通過直接與DNMT1相互作用,并特異地甲基化DNMT1的第142位賴氨酸,實(shí)現(xiàn)其對(duì)DNMT1數(shù)量和活性的抑制作用。因此，這些因子可以通過調(diào)控DNMT的數(shù)量和活性間接參與基因沉默,同時(shí)DNMT也通過這些因子參與其他水平的基因表達(dá)調(diào)控作用?！瘛馜NMTs將基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化也是抑制基因表達(dá)最常見的表觀遺傳現(xiàn)象之一。啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化后，甲基基團(tuán)本身以及甲基化DNA募集的甲基化結(jié)合蛋白，如MeCP2，所造成的空間位阻能夠抑制轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。此外，MeCP2可以募集組蛋白去乙酰化酶(HDAC)的結(jié)合，使甲基化DNA附近的組蛋白發(fā)生去乙?；?，形成較為緊密的染色質(zhì)構(gòu)象從而抑制轉(zhuǎn)錄。原理：2、DNMTs與基因印記基因印記是指來自父方和母方的等位基因在通過精子和卵子傳遞給子代時(shí)發(fā)生了某種修飾,這種作用使其后代僅表達(dá)父源或母源等位基因的一種。迄今,在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的印記基因大約有70多種,其表達(dá)控制著胚胎的發(fā)生、發(fā)育過程。與胚胎發(fā)育相關(guān)的DNMTs主要包括3種:DNMT1o、DNMT3a2、DNMT3L。在發(fā)育早期,DNMT1o是維持印記基因甲基化形式的主要酶之一。它在卵細(xì)胞1、4細(xì)胞階段存在于胞漿中,8細(xì)胞階段則轉(zhuǎn)移入核內(nèi)。胚泡植入后,DNMT1o則被DNMT1s取代。DNMT3L缺乏酶活性,然而卻是卵細(xì)胞從頭甲基化所必需的,DNMT3L缺乏引起不孕。●●3、DNMTs與基因組不穩(wěn)定性基因組不穩(wěn)定包括DNA序列改變,非整倍體性,染色體易位,基因拷貝數(shù)增加等。DNMTs可能從以下幾個(gè)方面影響基因組穩(wěn)定性：(1)影響端粒的完整性可能與DNMTs對(duì)非CpG位點(diǎn)的甲基化有關(guān)。而在DNMTs缺陷的胚胎干細(xì)胞中,這種甲基化修飾明顯減少,導(dǎo)致端粒重組增多,主要表現(xiàn)為姐妹染色體交換增多和端粒長(zhǎng)度不一(2)影響轉(zhuǎn)座元件的活性當(dāng)環(huán)境或其他因素導(dǎo)致DNMTs活性降低時(shí),基因組出現(xiàn)低甲基化狀態(tài),甲基化不足引起眾多轉(zhuǎn)座元件的激活,從而出現(xiàn)基因組不穩(wěn)定(3)影響DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)(MMR)的效率DNMT1的喪失可能阻礙DNA復(fù)制相關(guān)的MMR進(jìn)程,從而導(dǎo)致MMR效率的下降4、DNMTs與染色質(zhì)修飾體系組蛋白去乙?；?HDAC)是組蛋白修飾體系中的一個(gè)重要成份,轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物DNMTs/HDAC或MBP/HDAC參與沉默各種組織特異性基因和印記基因。參與polycomb蛋白(PcG)作用過程通過DNMTs保守的PHD結(jié)構(gòu),DNMT3a、DNMT1均能與H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1以及SUV39H1結(jié)合伴侶HP1β結(jié)合,影響它們甲基化H3K9的活性,并對(duì)H3K4甲基化也可能產(chǎn)生影響。此外,DNMT1能與hSNF2H染色質(zhì)重塑酶結(jié)合,高親和力結(jié)合DNA底物。⑴⑵⑶5、DNMTs與疾病DNMTs異?？赡芡ㄟ^3種方式改變DNA甲基化模式而導(dǎo)致疾病:正常情況下高甲基化的CpG島出現(xiàn)低甲基化或未甲基化的CpG島出現(xiàn)高甲基化,從而引起某些基因不正確地激活或沉默；印記基因失調(diào)影響機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育,與一些先天性疾病有關(guān)；DNMTs功能缺陷引起基因組不穩(wěn)定。⑴⑵⑶DNMTs與DNA高甲基化現(xiàn)在認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞具有以下特征:

逃避細(xì)胞死亡(resistingcelldeath)對(duì)生長(zhǎng)抑制信號(hào)不敏感(evadinggrowthsuppressors)誘導(dǎo)新血管生成(inducingangiogenesis)無限的復(fù)制潛能(enablingreplicativeimmortality)組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移(activatinginvasionandmetastasis)

持續(xù)的增殖信號(hào)(sustainingproliferativesignaling)能量代謝的改變(reprogrammingofenergymetabolism)逃避免疫系統(tǒng)的破壞(evadingimmunedestruction)近年來的研究發(fā)現(xiàn)，特定基因的DNA高甲基化在這些過程中均發(fā)揮重要作用。逃避細(xì)胞死亡通常情況下，細(xì)胞在接觸抑制輻射凋亡信號(hào)分子等刺激時(shí)會(huì)發(fā)生凋亡，但是癌細(xì)胞卻可以不受凋亡的控制，而大量分裂增殖。p53基因是一個(gè)重要的抑癌基因，可以促使損傷細(xì)胞發(fā)生凋亡，50%的癌癥中存在p53基因的突變失活。p53基因編碼區(qū)的甲基化狀態(tài)容易因?yàn)槊摪被饔冒l(fā)生5mC-T的轉(zhuǎn)換。同時(shí)，INK4a/ARF抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化可以使p14ARF表達(dá)下降，導(dǎo)致原來受p14ARF抑制的MDM2表達(dá)上升，MDM2進(jìn)而結(jié)合p53并使后者發(fā)生蛋白質(zhì)水平的降解，使細(xì)胞逃避p53引起的凋亡。BCL-2相關(guān)蛋白BNIP3，是一個(gè)凋亡相關(guān)因子，它定位于線粒體，可以誘導(dǎo)細(xì)胞在缺氧情況下發(fā)生凋亡。BNIP3啟動(dòng)子區(qū)域包含CpG島，細(xì)胞惡變時(shí)BNIP3啟動(dòng)子區(qū)高甲基化引起B(yǎng)NIP3表達(dá)沉默，導(dǎo)致細(xì)胞逃避缺氧時(shí)的凋亡?！瘛衽e例：對(duì)生長(zhǎng)抑制信號(hào)不敏感細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控存在多種機(jī)制，其中由pRb參與的G1/S檢測(cè)點(diǎn)調(diào)控尤其重要。未磷酸化的pRb與E2F結(jié)合，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。正常情況下p16蛋白與CDK4/6結(jié)合，阻止CDK復(fù)合物與周期蛋白D結(jié)合，使pRb不能磷酸化。p16基因的啟動(dòng)子區(qū)域甲基化后，其表達(dá)被抑制，使得p16蛋白依賴的TGF-β生長(zhǎng)抑制信號(hào)通路失去作用。調(diào)控機(jī)制：新血管的生成是癌癥發(fā)生中重要的步驟。誘導(dǎo)新血管生成血小管反應(yīng)蛋白1(thrombospondin-1，TSP1)是另一個(gè)抑制血管生成的蛋白，TSP1基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化引起基因表達(dá)抑制，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生過程中細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和血管生成。新血管生成首先需要金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMP)分解細(xì)胞外基質(zhì)，再通過血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)來誘導(dǎo)血管生成。組織金屬蛋白酶抑制劑3(met