電鏡練習(xí)題及參考答案

一、電鏡練習(xí)題及答案一、透射電鏡標(biāo)本取材的基本規(guī)定并簡要闡明。答：取材的基本規(guī)定如下：組織從生物活體取下后來，假如不立即進(jìn)行及時(shí)固定處理，就有也許出現(xiàn)缺血缺氧后的細(xì)胞超微構(gòu)造的變化，如細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞器變性或溶解等現(xiàn)象，這些都可導(dǎo)致電鏡觀測(cè)中的人為假象，直接影響觀測(cè)成果分析，甚至導(dǎo)致試驗(yàn)失敗。此外，由于處理不妥導(dǎo)致組織微生物污染，導(dǎo)致細(xì)胞的超微構(gòu)造構(gòu)造遭受破壞。因此，為了使細(xì)胞構(gòu)造盡量保持生前狀態(tài)，取材成敗是關(guān)鍵，取材成功的關(guān)鍵在于操作者必須要注意把握“快、小、冷、準(zhǔn)”四個(gè)取材要點(diǎn)。(1)．快：就是指取材動(dòng)作要迅速，組織從活體取下后應(yīng)在最短時(shí)間(爭取在1～2分鐘之內(nèi))投入前固定液。對(duì)于試驗(yàn)動(dòng)物，最佳在斷血流、斷氣之前就進(jìn)行取材，以免缺血缺氧后使細(xì)胞代謝發(fā)生變化而破壞細(xì)胞的超微構(gòu)造。當(dāng)然，最佳是采用灌注固定法。為了使前固定的效果更佳，組織塊要充足和固定液混合，應(yīng)采用振蕩固定10分鐘以上，有條件的可采用微波固定法固定。(2)．?。河捎诔Ｓ玫墓潭▌B透能力較弱，組織塊假如太大，塊的內(nèi)部將不能得到良好的固定。因此所取組織的體積要小，一般不超過1mm3。為便于定向包埋，可將組織修成大小約1mm×1mm×2mm長條形。(3)．冷：為了防止酶對(duì)自身細(xì)胞的酶解作用，取材操作最佳在低溫(5℃～15℃)環(huán)境下進(jìn)行，這樣可以減少酶的活性，防止細(xì)胞自溶。所采用的固定劑以及取材器械要預(yù)先在冰箱(5℃）中寄存一段時(shí)間。(4)．準(zhǔn)：就是取材部位要精確，這就規(guī)定取材者對(duì)所取的組織解剖部位要熟悉，必須取到與試驗(yàn)規(guī)定有關(guān)的部位，不一樣試驗(yàn)組別間要取相似部位，如需要定向包埋的標(biāo)本，則要作好定向取材工作。此外，還規(guī)定操作動(dòng)作輕柔，純熟，盡量防止?fàn)坷?、挫傷與擠壓對(duì)組織導(dǎo)致的人為損傷。什么是瑞利準(zhǔn)則？電鏡與光鏡在原理上有何相似和不一樣之處？答：1、光線通過二個(gè)比較靠近的小孔時(shí)，這二個(gè)小孔的衍射圖會(huì)重疊在一起。當(dāng)一種衍射圖的中央亮斑恰好落在另一種衍射圖的第一暗環(huán)中心時(shí)，這二個(gè)點(diǎn)剛可以分辯。這就是顯微鏡分辯本領(lǐng)的瑞利準(zhǔn)則。2、相似點(diǎn)：光學(xué)顯微鏡是運(yùn)用玻璃制作的透鏡對(duì)光進(jìn)行折射，將一物點(diǎn)發(fā)出不一樣角度的光線最終會(huì)聚成一種像點(diǎn)。電子顯微鏡是以電子束作為光源，運(yùn)用電磁透鏡產(chǎn)生的電場(chǎng)或磁場(chǎng)折射電子束，并通過電子束轟擊熒光屏激發(fā)熒光而到達(dá)成像目的。不一樣點(diǎn)：光鏡的照明源是可見光，而電鏡是用電子束照明。光鏡的透鏡用玻璃制成，而電鏡的透鏡是軸對(duì)稱的電場(chǎng)或磁場(chǎng)。簡述透射電鏡及掃描電鏡樣品制作流程答：1、透射電鏡樣品制作流程為取材——漂洗（生理鹽水）——前固定（2.5%戊二醛，4oC冰箱2小時(shí)以上）——漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）——后固定(1%鋨酸1小時(shí)左右)——漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）——塊染（1%醋酸鈾2小時(shí)）——梯度脫水（50%、70%、80%、90%丙酮各15分鐘，100%丙酮2次，各10分鐘）——浸透（丙酮：包埋液=1：1，37oC烘箱2小時(shí)；丙酮：包埋液=1：4，37oC烘箱過夜；純包埋液45oC烘箱2小時(shí)）——包埋聚合（45oC烘箱3小時(shí)，65oC烘箱48小時(shí)）。2、掃描電鏡樣品制作流程為取材（做好樣品觀測(cè)面的標(biāo)志）——漂洗（生理鹽水或緩沖液）——固定（2.5%戊二醛2小時(shí)以上）——漂洗（0.1M磷酸緩沖液，3次，45分鐘）——后固定（1%鋨酸，2小時(shí)）——脫水（50%、70%、80%、90%、95%各15分鐘，換醋酸異戊酯15分鐘或叔丁醇15分鐘）——干燥（零界點(diǎn)干燥或冷凍干燥）——鍍膜（真空鍍膜儀或離子濺射儀）四、常用的化學(xué)固定措施有哪些？答;常用的化學(xué)固定措施有1、浸泡固定法（也稱組織塊固定）：就是將組織塊直接浸泡入固定液當(dāng)中進(jìn)行固定。2、游離細(xì)胞固定法：合用于培養(yǎng)細(xì)胞、周圍血、骨髓、胸腹水或其他滲出液。如為貼壁生長的培養(yǎng)細(xì)胞，應(yīng)先用橡皮刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)管壁上輕輕刮下，或用酶消化，使細(xì)胞脫離管壁。3、原位固定法：就是在組織未取下之前，在組織器官本來的位置進(jìn)行預(yù)固定的措施。原位固定可分為點(diǎn)滴固定法和注射固定法兩種。點(diǎn)滴固定法：就是將試驗(yàn)動(dòng)物麻醉后暴露出所需的器官表面，小心地剝開包膜，將預(yù)冷的固定液直接滴在組織的表面上，并保持固定液合適濃度不使揮發(fā)干燥。注射固定法：就是將試驗(yàn)動(dòng)物麻醉后，將固定液用細(xì)注射針直接注射到所需固定的組織中或空腔臟器的內(nèi)部。4、灌注固定法就是運(yùn)用血液循環(huán)的途徑將固定液灌注到所需固定的組織中，其特點(diǎn)是灌注迅速、均勻，缺陷是固定操作復(fù)雜、規(guī)定高。灌注固定法可分為全身固定和局部固定兩種。一般采用的固定劑為2%～4%戊二醛溶液或者4%多聚甲醛溶液。五、一般透射電鏡包括那些構(gòu)造？請(qǐng)簡要論述。答：透射式電子顯微鏡（簡稱透射電鏡）由四部分構(gòu)成，即電子光學(xué)系統(tǒng)（即鏡筒）、真空排氣系統(tǒng)、電源系統(tǒng)和水冷系統(tǒng)。電子光學(xué)系統(tǒng)包括：照明系統(tǒng)、樣品室、成像系統(tǒng)和觀測(cè)記錄系統(tǒng)。真空排氣系統(tǒng)包括：機(jī)械泵、油擴(kuò)散泵、真空管道、閥門及檢測(cè)系統(tǒng)構(gòu)成。電源系統(tǒng)包括：重要的電源供應(yīng)包括高壓電源、電子槍燈絲電源、控制極電源、透鏡電源、真空系統(tǒng)電源等部分。水冷系統(tǒng)重要靠冷卻水循環(huán)裝置來完畢或者直接用自來水降溫。六、簡述電鏡在生命科學(xué)中的應(yīng)用答:電鏡在生命科學(xué)上的應(yīng)用幾乎包括所有的學(xué)科研究領(lǐng)域都已經(jīng)用到或即將用到電鏡技術(shù)。例如動(dòng)物或植物細(xì)胞的超微構(gòu)造（包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及其細(xì)胞器等內(nèi)容物、細(xì)胞間的連接等）的形態(tài)觀測(cè)，通過對(duì)比觀測(cè)，對(duì)動(dòng)植物形態(tài)在超微構(gòu)造水平上進(jìn)行分類、分型，以探討遺傳、變異及病理病因的機(jī)理或機(jī)制，為生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究所不可或缺的研究手段。運(yùn)用常規(guī)電鏡技術(shù)和特殊電鏡技術(shù)如免疫電鏡技術(shù)、電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、電鏡原位雜交技術(shù)等可以進(jìn)行細(xì)胞細(xì)胞超微構(gòu)造及超微病理分析，以及細(xì)胞內(nèi)抗原、酶等的定位、定性甚至定量研究等。七、簡述電鏡的球差和畸變及其形成原因。答：1、球差：由于電子束光源通過透鏡受到偏轉(zhuǎn)，通過樣品，從物平面向下發(fā)射，形成物點(diǎn)孔徑角。從物點(diǎn)發(fā)出的射線，抵達(dá)下一級(jí)透鏡又被匯集。假如透鏡有缺陷或孔徑角太大，則靠近光軸的射線和遠(yuǎn)離光軸的射線，受到電磁場(chǎng)的作用就會(huì)不一樣，這些射線在光軸上會(huì)聚的位置不一樣，成果遠(yuǎn)離光軸的射線就會(huì)在像面上形成一種最小模糊圈。此時(shí)可有圖象中央凸起感。球差是目前影響電鏡辨別率的一種重要原因。2、畸變：由于離軸較遠(yuǎn)處的徑向磁場(chǎng)的作用力強(qiáng)，使放大倍數(shù)隨物點(diǎn)離軸的距離而變化，進(jìn)而使圖象發(fā)生變化而產(chǎn)生的?；兂Ｒ姷挠姓硇位儭⑼靶位兒蚐形畸變等。八、簡述電磁透鏡及其聚焦原理答：由于軸對(duì)稱彎曲磁場(chǎng)對(duì)電子束有聚焦作用，因而可以得到電子光學(xué)像。我們稱這種具有軸對(duì)稱彎曲磁場(chǎng)裝置構(gòu)成的電子透鏡為電磁透鏡（electronmagneticlenses）。由于電磁透鏡磁場(chǎng)非均勻分布，物、像點(diǎn)在磁場(chǎng)之外，電子在磁場(chǎng)中既受到軸向分量的作用，又受到徑向分量的作用，使平行于軸進(jìn)入磁場(chǎng)的電子束可獲得聚焦。九、什么是反差？簡述電鏡熒光圖像反差形成的原因。答：1、人的眼睛在辨別物體時(shí)，重要根據(jù)物體不一樣部位或物體之間的光強(qiáng)度與波長的差異，這些差異構(gòu)成了物體的反襯度，又稱為“反差”。電鏡與光鏡同樣也存在反差現(xiàn)象。2、由于電鏡標(biāo)本上的不一樣部位的物質(zhì)構(gòu)造不一樣，通過電子染色后，其疏密度也不一樣，它們散射電子的能力也各不相似，散射電子能力強(qiáng)的地方，顯現(xiàn)為暗像；相反，散射能力弱的地方，顯現(xiàn)為亮像。因此，在熒光屏上所看到的是由暗像與亮像構(gòu)成的具有一定反差的熒光圖像。十、游離細(xì)胞取材措施有哪些?并簡述其處理措施。答：血漿凝集法：將抗凝全血離心分層（轉(zhuǎn)/每分鐘，10—20分鐘），用毛細(xì)吸管沿著管壁輕輕的將上清夜吸?。ú灰茐陌准?xì)胞層），接著用吸管吸取固定液，并沿著管壁將2.5%戊二醛固定液慢慢地加入進(jìn)行固定，然后把它放在4℃冰箱內(nèi)保留。血漿（血清）混合法：如為細(xì)菌、病毒、脫落細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞則先將它們制成懸液放置于離心管內(nèi)（最佳是玻璃的），離心成團(tuán)（1000～3000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘，下同），去上清液后加入2.5%戊二醛固定10分鐘左右，離心，再棄去多出的固定液，然后和少許抗凝血漿或血清混合均勻，離心成團(tuán)，去上清液（留少許），用吸管吸取2.5%戊二醛固定液沿著離心管壁緩慢滴入，盡量防止團(tuán)塊分散，靜置于4℃冰箱內(nèi)保留備用。十一、簡述超薄切片流程并簡要闡明。答：超薄切片流程包括如下幾種環(huán)節(jié)：1、切片前的準(zhǔn)備：銅網(wǎng)清洗（用丙酮和乙醇浸洗）2、支持膜制備：常用Formvar膜（用聚乙烯醇縮甲醛和氯仿配置，濃度為0.5%）3、玻璃刀制備：專用制刀機(jī)制作。4、半薄切片光鏡定位（重要確定超薄切片的位置）。5、修塊（表面修成梯形或長方形）。6、超薄切片：專用超薄切片機(jī)切片，厚度在50—100nm之間較為合適。7、撈片：將超薄切片撈在載網(wǎng)上。8、染色：鉛-鈾雙重染色法，如已經(jīng)有過塊染，則只需鉛染色30分鐘即可。十二、簡述負(fù)染技術(shù)及其應(yīng)用。答：負(fù)染技術(shù)是運(yùn)用重金屬鹽（常用磷鎢酸鹽或醋酸鈾溶液）沉積到樣品四面，樣品四面散射電子的能力就較強(qiáng)，因而體現(xiàn)為暗區(qū)；樣品自身散射電子的能力較弱，則體現(xiàn)為亮區(qū)，這樣便能把樣品的外形與表面構(gòu)造清晰地烘托出來。是觀測(cè)微小顆粒狀生物材料的外部形狀常用的染色措施。重要應(yīng)用于病毒、支原體、細(xì)菌等微生物外部形態(tài)的觀測(cè)以及納米級(jí)生物材料的形態(tài)觀測(cè)。十三、簡述石蠟塊做超薄切片的樣品制作流程答、石蠟塊做超薄切片的樣品制作流程如下：1、取材：從石蠟塊上對(duì)應(yīng)部位切下約1mm3的小塊。2、溶蠟：將取下的標(biāo)本放在一張濾紙上，40℃烘箱內(nèi)烘1小時(shí)，然后轉(zhuǎn)放入二甲苯溶液中40℃烘箱內(nèi)繼續(xù)浸泡8—12h。3、水化：純丙酮30分鐘、90%、80%、70%丙酮各15分鐘。4、漂洗：用緩沖液漂洗（0.1M磷酸緩沖液PBS)3次，每次15分鐘。5、固定：2.5%戊二醛固定2小時(shí)，PBS漂洗3次,而后1%鋨酸后固定1—2小時(shí)。6、漂洗、塊染、脫水、浸泡、包埋聚協(xié)議常規(guī)透射電鏡標(biāo)本制作措施。二、選擇題及答案人眼的平均辨別率為（B）A0.4mmB0.2mmC0.3mmDO.2μmE0.4μm電子槍產(chǎn)生的電子是（A）A入射電子B透射電子C彈性散射電子D二次電子E俄歇電子用來顯示組織和細(xì)胞的內(nèi)部超微構(gòu)造像的電子為（B）A入射電子B透射電子C彈性散射電子D二次電子E反射電子下面哪項(xiàng)不屬于透射電鏡樣品制備技術(shù)（A）A鍍膜B負(fù)染技術(shù)C電鏡細(xì)胞化學(xué)技術(shù)D超薄切片技術(shù)E半薄切片技術(shù)5、下面哪項(xiàng)不屬于掃描電鏡樣品制備技術(shù)（B）A表面干燥法B浸透包埋C冷凍復(fù)型D冷凍割斷法E組織導(dǎo)電法6、下面哪種電鏡可以在觀測(cè)構(gòu)造的同步，對(duì)組織細(xì)胞內(nèi)的元素成分進(jìn)行分析（C）A透射電鏡B掃描電鏡C分析電鏡D超高壓透射電鏡E原子力顯微鏡7、觀測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)部超微構(gòu)造應(yīng)選用哪種電鏡（B）A原子力顯微鏡B透射電鏡C掃描電鏡D磁力顯微鏡E側(cè)向力顯微鏡8、下面哪項(xiàng)不是超高壓電子顯微鏡的長處（E）A可用于觀測(cè)厚切片B可以提高辨別率C可提高圖像質(zhì)量D可觀測(cè)復(fù)雜的構(gòu)造E減少輻射損傷范圍9、下面對(duì)掃描電鏡的描述錯(cuò)誤的是（B）A運(yùn)用反射電子和二次電子成像B用于觀測(cè)組織細(xì)胞表面形貌C樣品室大，可用于觀測(cè)塊狀樣品D景深長，立體感強(qiáng)E樣品可被升降和傾斜10、電子槍由（D）構(gòu)成A陰極、陽極B陰極、柵極C陽極、柵極D陰極、陽極、柵極E正極、負(fù)極、柵極11、二次電子監(jiān)測(cè)系統(tǒng)不包括（E）A檢測(cè)器B陰極射線管C閃爍器D光電倍增器E視頻放大器12、固定液中戊二醛的常用濃度為（C）A0.5%B2.0%C2.5%D4%E10%13、下面對(duì)透射電鏡描述不對(duì)的的是（D）A運(yùn)用透射電子成像B觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)部超微構(gòu)造C可觀測(cè)負(fù)染標(biāo)本D景深長、立體感強(qiáng)E辨別率高，性能最完善14、透射電鏡的反差取決于樣品對(duì)（B）的散射能力A二次電子B入射電子C透射電子D散射電子E反射電子15、觀測(cè)生物樣品時(shí)，透射電鏡的加速電壓一般為（C）A20-50KVB50-80KVC80-100KVD100-120KVE120KV以上16、超薄切片是指厚度不不小于（D）的切片A200nmB300nmC400nmD100nmE500nm17、超薄切片技術(shù)的環(huán)節(jié)為（B）A取材、固定、脫水、包埋、切片、染色B取材