飼用枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

飼用枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化周映華;吳勝蓮;賀月林繆東【期刊名稱】《《湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)》》【年(卷)，期】2010(000)011【總頁(yè)數(shù)】3頁(yè)(P21-23)【關(guān)鍵詞】枯草芽孢桿菌;培養(yǎng)基;發(fā)酵條件;優(yōu)化【作者】周映華;吳勝蓮;賀月林;繆東【作者單位】湖南省微生物研究所湖南長(zhǎng)沙410009【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類】S816.3枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)基我國(guó)農(nóng)業(yè)部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一，已被越來(lái)越多的研制成微生物制劑。其制劑是無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)污染的〃綠色”添加劑，具有廣闊的發(fā)展前景，現(xiàn)已在畜牧業(yè)、飼料行業(yè)中廣泛應(yīng)用，顯示出了巨大的社會(huì)效益和生態(tài)效益?？莶菅挎邨U菌具有很強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性，能產(chǎn)生抗菌素，在動(dòng)物腸道內(nèi)具有較強(qiáng)生物奪氧能力，這些特性對(duì)促進(jìn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的消化吸收、提高動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率和防病，促進(jìn)生長(zhǎng)起到重要作用。目前在工業(yè)化生產(chǎn)中，仍然存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、芽孢形成率低、成本高等問(wèn)題。筆者對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，以期提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本。1材料與方法1.1材料1.1.1菌種供試菌種為枯草芽孢桿菌，由湖南省微生物研究所菌種保藏室提供。1.1.2培養(yǎng)基檢測(cè)培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白腺1%，葡萄糖1%，氯化鈉0.5%,瓊脂2%；種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.3%，蛋白腺1%，氯化鈉0.5%,pH7.0~7.2;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉0.15%、葡萄糖0.5%、尿素0.1%、磷酸氫二鉀0.3%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、酵母膏0.02%、氯化鐵0.01%、碳酸鈣0.01%、大豆粕1%、淀粉0.3%、3.08%濃度的硫酸錳溶液0.1%。pH均調(diào)為7.0~7.2。1.1.3儀器設(shè)備供試儀器：SHP-250生化培養(yǎng)箱、1600倍微生物顯微鏡、PHS—25型數(shù)顯酸度計(jì)、?，擰YC—211搖床、電熱鼓風(fēng)干燥箱等。1.2方法1.2.1發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化采用四因素三水平L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)24h后，通過(guò)稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，芽孢率采用芽孢染色后顯微鏡下計(jì)數(shù)比較。光密度（OD600）值測(cè)定采用光電比濁計(jì)數(shù)法，以活菌數(shù)的高低作為評(píng)價(jià)培養(yǎng)基優(yōu)劣的指標(biāo)。1.2.2發(fā)酵條件的優(yōu)化（1）溫度對(duì)生長(zhǎng)量的影響：選取20、25、30、35、37、40OC6個(gè)溫度作為搖床發(fā)酵溫度，在初始pH7.0，轉(zhuǎn)速220r/min條件下培養(yǎng)24h，測(cè)定其OD600值。（2）起始pH值對(duì)生長(zhǎng)量的影響：將培養(yǎng)基的初始pH調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、7.8、8.0，在接種量5%，溫度30C,轉(zhuǎn)速220r/min條件下培養(yǎng)24h，測(cè)定其OD600值。（3）轉(zhuǎn)速對(duì)生長(zhǎng)量的影響：選取150、200、220、250、300r/min5個(gè)轉(zhuǎn)速，在發(fā)酵液初始pH7.2，溫度30C條件下培養(yǎng)24h，測(cè)定其OD600值。（4）接種量對(duì)生長(zhǎng)量的影響：選取接種量1%、3%、5%、7%、10%、15%，在30C,初始pH7.2，轉(zhuǎn)速220r/min條件培養(yǎng)24h，測(cè)定其OD600值。1.2.3發(fā)酵罐試驗(yàn)在搖瓶?jī)?yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了20L發(fā)酵罐的擴(kuò)大培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)條件為：初始pH7.0~7.2，溫度30°C，轉(zhuǎn)速220r/min,121°C滅菌30min,起始?xì)饬髁勘萳：0.5。鏡檢芽孢率達(dá)到85%以上時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。2結(jié)果與分析2.1發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化由表1可見(jiàn)，對(duì)枯草芽孢桿菌發(fā)酵影響的次序?yàn)椋憾蛊伞档矸邸灯咸烟?gt;硫酸錳，即豆粕對(duì)菌體增殖的影響最大，其次是淀粉、葡萄糖，最后為硫酸錳。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖0.5%、淀粉0.3%、豆粕3%、3.08%硫酸錳0.2ml、磷酸氫二鉀0.3%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、酵母膏0.02%、氯化鐵0.01%、碳酸鈣0.01%。表1正交試驗(yàn)處理123456789I活菌數(shù)（108個(gè)/mL）3.102.2712.64.400.720.394.850.853.56芽孢率（%）>80>80>80>80>80>80>80>80>80jHjmjKjIj/Kjnj/Kjmj/KjDj葡萄糖（%）0.500.500.501.001.001.001.501.501.5017.975.519.263.005.991.843.094.15淀粉（%）00.150.3000.150.3000.150.3012.353.8416.553.004.121.285.524.24豆粕（%）1.002.003.002.001.003.003.001.002.004.6710.2317.843.001.563.415.954.39硫酸錳（%）00.100.200.2000.100.100.2007.387.5117.853.002.462.505.953.49 2.2發(fā)酵條件的優(yōu)化2.2.1溫度對(duì)生長(zhǎng)量的影響由圖1可見(jiàn)，在20~30C時(shí)，隨著溫度的升高，OD600值升高。在30C時(shí)OD600值最大，高于30C時(shí)，OD600值反而下降，因而枯草芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)溫度為30C。圖1不同溫度對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響2.2.2起始pH值對(duì)生長(zhǎng)量的影響發(fā)酵過(guò)程中pH難以控制，一般控制發(fā)酵液的初始pH。由圖2可見(jiàn)，枯草芽孢桿菌的適宜pH范圍為7.0~7.2。2.2.3轉(zhuǎn)速對(duì)生長(zhǎng)量的影響枯草芽孢桿菌是需氧菌，通過(guò)改變轉(zhuǎn)速可以調(diào)節(jié)通氣量。轉(zhuǎn)速太小，通氣量小，不利于菌體生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)速太大時(shí)，菌體生長(zhǎng)量反而減少。由圖3可見(jiàn)，隨著轉(zhuǎn)速的提高，OD600值升高。超過(guò)220r/min后，其OD600值反而下降。枯草芽孢桿菌的最適轉(zhuǎn)速為220r/min。圖2不同pH對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響圖3不同轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)量的影響2.2.4接種量對(duì)生長(zhǎng)量的影響由圖4可見(jiàn)，隨著接種量的增加，其OD600值升高，超過(guò)10%的接種量后，OD600值反而下降，因此枯草芽孢桿菌的最適接種量為10%。圖4不同接種量對(duì)生長(zhǎng)量的影響2.3發(fā)酵罐試驗(yàn)發(fā)酵罐試驗(yàn)結(jié)果表明：發(fā)酵周期與搖瓶發(fā)酵基本一致，含菌量達(dá)1.58x1010個(gè)/mL,放罐時(shí)間20~22h。由于發(fā)酵罐的攪拌和通氧條件均優(yōu)于搖瓶發(fā)酵，因此菌體濃度和芽孢形成率都比搖瓶發(fā)酵好。3結(jié)論采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定其培養(yǎng)24h后的活菌數(shù)，以活菌數(shù)的高低作為評(píng)價(jià)培養(yǎng)基優(yōu)劣的指標(biāo)。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：葡萄糖0.5%、淀粉0.3%、豆粕3%、磷酸氫二鉀0.3%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、酵母膏0.02%、氯化鐵0.01%、碳酸鈣0.01%、3.08%硫酸錳0.2mL。并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)法確定了最佳培養(yǎng)條件為：溫度30OC，初始pH7.0~7.2，轉(zhuǎn)速220r/min，接種量10%。進(jìn)行了發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，最適放罐時(shí)間20-22h,獲得的菌體數(shù)量約為1.58x1010個(gè)/mL,為大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)提供了有益借鑒。參考文獻(xiàn)：何明清，倪學(xué)勤.我國(guó)動(dòng)物微生態(tài)制劑研究、開(kāi)發(fā)和應(yīng)用動(dòng)態(tài)[J].飼料廣角，2002，（21）：1-7.周慶安，劉文剛，鄧留坤，等.動(dòng)物微生態(tài)劑制及其應(yīng)用[J].飼料博覽，2003，（4）：11-13.李研東.動(dòng)物微生態(tài)制劑的使用現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J].河北畜牧獸醫(yī)，2005，（4）：48-50.康杰，郎淑妮.概述益生菌的功能及應(yīng)用[J].貴州畜牧獸醫(yī)，2008，32（2）：28-29.郝生宏，佟建明，薩仁娜，等.益生菌安全性及其潛在功能研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2004，31（9）：9-12.秦玉昌，潘寶海，于榮，等.芽孢對(duì)畜禽生產(chǎn)性能的影響[J].中國(guó)飼料，2004，16:8-10.王進(jìn)華，戚薇，陳瑩，等.凝結(jié)芽孢桿菌芽孢形成液體