無籽甌柑花粉形態(tài)及花粉生活力比較研究

無籽甌柑花粉形態(tài)及花粉生活力比較研究

杏仁是南宋蓮花沿岸最具特色的當?shù)馗涕倨贩N。其果實倒卵形,風味獨特,略帶苦味,11月中下旬成熟,常溫下可貯藏至翌年5月,風味不變。但是,普通甌柑存在籽多、可食率低等缺點。為了充分開發(fā)甌柑資源,麗水市山水果樹研究所和麗水市林科所在浙江省科技廳等單位的資助下,從1996年開始甌柑品種的選育,選育出的無籽甌柑Citrussuavisslima‘Seedless’新品種于2004年通過了浙江省林木良種審定委員會的良種認定。本文從花粉的角度對無籽甌柑等4個品種的花粉進行了比較研究,以揭示無籽甌柑無核的原因。1材料和方法1.1含基本花限的花限供試品種為無籽甌柑、普通甌柑、處紅柚Citrusgrandis‘Chuhong’和翡翠柚Citrusgrandis。這些品種含苞欲放的花苞2004年4月25日采自浙江省麗水市。樣品采后立即帶回實驗室,置4℃冰箱中,并立即用于各項指標的測定。1.2指標和方法的測量在對各品種花苞形態(tài)及散粉情況進行觀察的基礎(chǔ)上,就以下指標進行了測定。1.2.1固定花粉培養(yǎng)基在載玻片上滴上液態(tài)瓊脂,待凝固后將花粉吹到瓊脂培養(yǎng)基上,以固定花粉。在光學顯微鏡下觀察花粉粒的形態(tài),用顯微尺測量花粉的極柚長和赤道軸長。1.2.2平均花粉的測定按徐小彪等的方法進行花粉量測定。取未開裂的花藥60粒于研缽中研碎,使花粉粒充分散出,用蒸餾水洗滌,將洗液合并,加1滴吐溫-80,并定容至12.5mL。測定前搖勻,用移液槍取1滴置于血球計數(shù)器中(0.1mm,1/400mm2),在10倍的顯微鏡下觀察,數(shù)出每一中格中的花粉數(shù)。每一花藥中的平均花粉量用公式n=(A×12.5×1000×10)/60計算。這里A為每一中格的花粉數(shù),n為每一花藥中的平均花粉量。1.2.3無生命力的花粉花粉生活力測定采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法和碘-碘化鉀法。在聯(lián)苯胺-過氧化氫法中,先在懸滴玻片上加上少量分散的花粉,再加上1滴由聯(lián)苯胺、α-萘酚和碳酸鈉溶液混合而成的溶液,靜置片刻后再加上1滴稀釋了的體積分數(shù)為30%過氧化氫溶液。3~4min后在顯微鏡下觀察,呈紅色或深紅色的花粉是有生命力的花粉,染色很淺或無色的是無生命力的花粉。在碘-碘化鉀法中,在少量的花粉上滴上碘-碘化鉀溶液,3~4min后在顯微鏡下觀察,染成黑褐色或紅褐色的花粉是有生命力的,而顏色淺或無色的花粉是無生命力的。如果花粉濕度過大而使花粉無法正常散出,則把花藥和試劑一起研磨后觀察,不影響實驗結(jié)果。每個品種每種方法觀察10個懸滴玻片,每片取5個視野,并計算有生活力花粉的百分比。1.2.4花粉的發(fā)芽率測定將花苞置于24~26℃恒溫培養(yǎng)箱中干燥8h,使其花粉充分散出。將配制的瓊脂(10g·kg-1)-蔗糖(50~200g·kg-1,每50g·kg-1一個梯度)固體培養(yǎng)基在微波爐中加熱融解,用移液槍將液態(tài)培養(yǎng)基滴到載玻片上,冷卻后將花粉接種到培養(yǎng)基上。然后將載玻片放入帶有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中,蓋上培養(yǎng)皿的蓋子,將培養(yǎng)皿放置在24~26℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,鏡檢發(fā)芽率。每個梯度觀察10個玻片,每片取5個視野,并計算花粉發(fā)芽率。2結(jié)果與分析2.1無籽下的織物4個品種中以翡翠柚的花苞最大,其次為處紅柚,無籽甌柑與普通甌柑的花苞較小,大小相近;柚類的花瓣數(shù)較甌柑少,只有4~5個;4個品種的花藥數(shù)相近,每朵為24~31個花藥,無籽甌柑的雄蕊中有1~2個雄蕊相對較長,而普通甌柑的雄蕊長短幾乎一致。另外,4個品種的花苞室內(nèi)放置2~3d后觀察,發(fā)現(xiàn)花苞自然開裂,普通甌柑、處紅柚和翡翠柚的花藥上有自然散發(fā)的花粉,而無籽甌柑的花藥上卻罕見自然散發(fā)的花粉。2.2不同品種及花粉的長度花粉粒長寬度測定結(jié)果見表1。4個品種的花粉呈長圓形,無畸形。無籽甌柑、普通甌柑和處紅柚花粉的寬度接近,無明顯差異,翡翠柚的花粉明顯地比其他3個品種要寬,平均達27.19μm。普通甌柑與處紅柚花粉的長度相近,但普通甌柑的花粉明顯地比無籽甌柑的花粉要長,4個品種中還是翡翠柚的花粉最長,達47.18μm。從花粉的長寬比來看,無籽甌柑的比值最小,其余3個品種相近。可以認為無籽甌柑的花粉粒最小,翡翠柚的花粉粒最大。2.3紅柚的花粉量花粉量測定的結(jié)果見圖1。實驗結(jié)果表明,無籽甌柑和普通甌柑的花粉量接近,兩者無明顯差異,分別為1105?！せㄋ?1和1130?！せㄋ?1;處紅柚的花粉量約是無籽甌柑與普通甌柑的2倍;翡翠柚的花粉量為4884?！せㄋ?1,是4個品種中數(shù)量最多的,分別約是甌柑的4倍和處紅柚的2倍,和其他3個品種的花粉數(shù)量有明顯的差異。2.4花粉的生活力測定用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定的結(jié)果表明,普通甌柑花粉的生活力與翡翠柚和處紅柚的花粉生活力相當,翡翠柚、處紅柚和普通甌柑分別為87.14%,85.63%和85.24%,無籽甌柑花粉的生活力略低,為75.89%。用碘-碘化鉀法測定4個品種花粉生活力的結(jié)果與聯(lián)苯胺-過氧化氫法基本一致,悲翠柚、處紅柚和普通甌柑分別為87.54%,84.62%和85.15%,而無籽甌柑的生活力最低,為75.13%(表2)。實際操作時,聯(lián)苯胺-過氧化氫法比碘-碘化鉀法更為簡便。2.5花粉在培養(yǎng)基上的發(fā)芽率蔗糖質(zhì)量分數(shù)是影響花粉發(fā)芽率的重要因素之一。通過預(yù)備實驗,發(fā)現(xiàn)無籽甌柑在50~200g·kg-1(50g·kg-1一個梯度)4種不同蔗糖質(zhì)量分數(shù)的培養(yǎng)基上均無發(fā)芽;普通甌柑、處紅柚和翡翠柚在質(zhì)量分數(shù)為50g·kg-1與200g·kg-1的培養(yǎng)基上的發(fā)芽率極低,一般低于5%,可以認為沒有發(fā)芽,而蔗糖質(zhì)量分數(shù)為100g·kg-1和150g·kg-1培養(yǎng)基上的花粉發(fā)芽率接近。因此,同一花粉在不同蔗糖質(zhì)量分數(shù)的培養(yǎng)基上,其發(fā)芽率是各不相同。普通甌柑和處紅柚培養(yǎng)基最佳的蔗糖質(zhì)量分數(shù)為150g·kg-1,發(fā)芽率分別為49.5%和39.62%,而翡翠柚培養(yǎng)基最佳的蔗糖質(zhì)量分數(shù)為100g·kg-1,發(fā)芽率為44.76%(表3)。花粉在培養(yǎng)基上的培養(yǎng)時間一般不宜超過48h,因為所有的操作都是非無菌操作。48h后觀察,只能在顯微鏡下觀察到成團的霉菌和被污染的花粉,而且霉菌生長消耗了大量的養(yǎng)分,在霉菌斑旁邊的花粉,花粉管根本無法萌發(fā),即使有也很細小。3無籽漳柑花粉無核的存在原因造成柑橘無核的主要原因有花藥及花粉母細胞退化、減數(shù)分裂中染色體變異、花粉粒退化和環(huán)境異常等引起的雄性不育、胚囊育性下降、自交不親和及胚胎敗育等因素,而雄性不育表現(xiàn)為花藥退化、花藥內(nèi)無花粉和花粉敗育。在本研究中,通過對無籽甌柑花粉的形態(tài)觀察和測定,發(fā)現(xiàn)無籽甌柑花器發(fā)育正常,不存在花粉畸形引起無核。無籽甌柑的花粉雖然很少,但和普通甌柑相接近,而普通甌柑在如此少的花粉量下能產(chǎn)生種子,說明無籽甌柑無核的原因不可能是花藥退化或者花藥內(nèi)不產(chǎn)生花粉引起的。無籽甌柑與普通甌柑花粉性狀上的主要差異是其花粉幾乎不發(fā)芽和很少有自然散發(fā)的花粉,盡管實驗表明無籽甌柑的花粉具有生活力。一般花粉生活力低與花粉敗育總是聯(lián)系在一起的,但在山葡萄品種雙慶Vitiusvenifera‘Shuangqing’及巨峰Vitiusvenifera‘Kyoho’中,其花粉的生活力分別達71%和66%,但存在因花粉敗育而導(dǎo)致自然坐果率低的現(xiàn)象。因此花粉敗育和自然散發(fā)花粉少是無籽甌柑無核的主要原因。DNA水平的研