冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證血漿差異蛋白組學(xué)研究

冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證血漿差異蛋白組學(xué)研究

非穩(wěn)定型心絞痛（iup）是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化最常見的類型，也是心血管疾病最常見的綜合征之一。aep的預(yù)防和治療已成為臨床難題之一。血瘀證是心絞痛中常見的中醫(yī)證候表現(xiàn)。心絞痛的發(fā)病機(jī)制現(xiàn)仍然不完全清楚,尚無(wú)早期診斷的特異性標(biāo)志物。近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,為研究心絞痛的發(fā)病機(jī)制和探索早期診斷的生物標(biāo)志物提供了新的思路和技術(shù)平臺(tái)。冠心病心絞痛發(fā)生過(guò)程中,人體器官病理變化的產(chǎn)物可釋放入血,導(dǎo)致血漿蛋白在結(jié)構(gòu)和數(shù)量上的改變,因此,研究心絞痛狀態(tài)時(shí)的人體血漿蛋白質(zhì)組變化有著非常重要的意義。本研究采用雙向凝膠電泳和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)心絞痛血瘀證患者和健康對(duì)照組人群血漿水平的確存在差異,為了尋找更多的差異蛋白,現(xiàn)采用Agilent抗體柱去除血漿中的高豐度蛋白后,再進(jìn)一步行雙向凝膠電泳分析。1對(duì)象和方法1.1中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)6例冠心病不穩(wěn)定型心絞痛痰瘀互阻證、9例冠心病不穩(wěn)定型心絞痛氣虛血瘀證住院患者,其中男7例,女8例,年齡69±14歲,均符合ACCAHAACP-ASIM聯(lián)合議定的“慢性穩(wěn)定型心絞痛診療指南(1999年)”以及中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)2000年制訂的“不穩(wěn)定型心絞痛診斷和治療建議”標(biāo)準(zhǔn)。氣虛血瘀證的診斷采用2002年國(guó)家食品與藥品監(jiān)督管理局《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》制定的標(biāo)準(zhǔn),痰瘀互阻證為兼有心血瘀阻證和痰阻心脈證者。同時(shí)排除以下疾病患者:急性心肌梗死、心肌炎、心臟神經(jīng)官能癥、肋間神經(jīng)痛;其他疾病引起的心絞痛,如風(fēng)濕熱、梅毒、先天性冠狀動(dòng)脈畸形、肥厚型心肌病、主動(dòng)脈瓣狹窄或關(guān)閉不全者;合并有腦中風(fēng)、糖尿病、肺部感染、腎炎、腎功能衰竭、泌尿系感染、風(fēng)濕病、肝、腎、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病及骨關(guān)節(jié)病者;妊娠期或哺乳期患者,過(guò)敏體質(zhì)患者。12例健康人年齡、性別相匹配,無(wú)血瘀證表現(xiàn),其余基本情況一致。1.2edta抗凝、封裝15例患者于入院2天內(nèi)取清晨空腹肘靜脈血2mL,EDTA抗凝,經(jīng)4℃、3000rmin離心10min。取上清,分裝,-80℃保存。健康人也于清晨取空腹肘靜脈血,方法同上。1.3試劑及試劑pH4-7固相pH梯度干膠條(IPG)、IPGbuffer(pH3-10NL)、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)、二硫蘇糖醇(DTT)、礦物油、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)及考馬斯亮藍(lán)R350購(gòu)自美國(guó)GE公司,過(guò)硫酸銨(AP)、瓊脂糖和甘氨酸購(gòu)自美國(guó)Amresco公司,其它試劑購(gòu)自北京試劑公司。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q去離子水。1.4試驗(yàn)儀器及質(zhì)譜儀EttanIPGphorⅡ等電聚焦儀、EttanDALTsix雙向垂直電泳儀、MultiTempⅢ溫控循環(huán)水浴及EPS601電源均為美國(guó)GE公司產(chǎn)品。質(zhì)譜儀為Bruker公司Ultraflextoftof。分析軟件為Imagemaster6.0,GEhealthcare。1.5高、低豐度蛋白的分離將各樣品加入3倍量的BufferA,15000g離心10min,取上清進(jìn)樣,根據(jù)保留時(shí)間、色譜峰分別收集高豐度和低豐度蛋白。色譜條件:流速為0.25mLmin,柱溫為室溫,檢測(cè)波長(zhǎng)250nm,進(jìn)樣量30μL,得到了較高的重復(fù)性(圖1)。1.6蛋白質(zhì)上樣和上樣將各組樣品分別混合,參照Amersham公司雙向電泳手冊(cè)和Gorg等的方法進(jìn)行。采用IPG預(yù)制膠條24cmpH3-10NL。用Bradford法進(jìn)行蛋白定量,再用水化液調(diào)整到合適濃度后上樣。蛋白質(zhì)上樣量1.3mg,梯度升壓,等電聚焦總伏小時(shí)為100kVh平衡后膠條轉(zhuǎn)移至13.5%十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠(SDS)上進(jìn)行第2向電泳。16℃恒溫,采用恒功率電泳,開始時(shí)2.5W、1h,再用15W至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底部邊緣。1.7凝膠染色電泳結(jié)束后,凝膠固定過(guò)夜,R35090℃染色10min,脫色至背景透明。1.8凝膠的點(diǎn)檢測(cè)及匹配凝膠通過(guò)UMAX2100XL掃描,膠圖數(shù)據(jù)存儲(chǔ)后,采用Imagemaster2DPlatinum6.0軟件進(jìn)行凝膠的蛋白點(diǎn)檢測(cè)及匹配,配合三維圖像、Histogram及人工校對(duì)等方法,以保證點(diǎn)檢測(cè)及匹配的準(zhǔn)確性。1.9質(zhì)差異點(diǎn)抽提法獲得肽質(zhì)量指紋圖切割蛋白質(zhì)點(diǎn)置于Eppendorf管中,進(jìn)行膠內(nèi)蛋白質(zhì)酶解后,將從蛋白質(zhì)差異點(diǎn)抽提所得的肽段通過(guò)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析,獲取蛋白樣品的肽質(zhì)量指紋圖(由北京華大蛋白質(zhì)組研發(fā)中心完成),最后應(yīng)用Mascot軟件在人類蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI、SWISS-PROT)中搜尋,獲得蛋白質(zhì)的相關(guān)信息。2結(jié)果2.1圖像分析和差異點(diǎn)分析經(jīng)Imagemaster2DPlatinum6.0軟件進(jìn)行圖像的強(qiáng)度校正、點(diǎn)檢測(cè)、匹配等分析,根據(jù)1.5倍水平差異作為標(biāo)準(zhǔn),在冠心病不穩(wěn)定型心絞痛氣虛血瘀證和痰瘀互阻證中檢測(cè)出16個(gè)差異點(diǎn)(圖2)。2.2冠心病不穩(wěn)定型心絞痛析藥血漿中1-酸性糖蛋白、2-抗胰蛋白酶、2-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變化對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行酶解、質(zhì)譜分析,用Mascot軟件搜索鑒定出8種蛋白質(zhì)。其中α1-酸性糖蛋白、結(jié)合珠蛋白α1鏈、α1-抗胰蛋白酶、結(jié)合珠蛋白β鏈和結(jié)合珠蛋白α2鏈在冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證患者血漿中水平升高,載脂蛋白AⅣ、載脂蛋白AⅠ和甲狀腺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證患者血漿中水平降低(表1和圖3)。3糖尿病患者的凝血蛋白及代謝產(chǎn)物的變化對(duì)于血漿高豐度蛋白的去除,本研究使用了美國(guó)Agilent公司的多克隆抗體親和柱,可以去除血漿中6種豐度最高的蛋白(白蛋白、IgG、IgA、抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白和結(jié)合珠蛋白),雖然去除效率不是100%,在最后的質(zhì)譜鑒定中,還是發(fā)現(xiàn)了結(jié)合珠蛋白、α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)等去除目標(biāo)蛋白,而且是作為差異蛋白。但去除高豐度蛋白的重復(fù)性很好,且剩余結(jié)合珠蛋白、抗胰蛋白酶的變化趨勢(shì)與原血漿一致,基本達(dá)到了去除血漿高豐度蛋白的預(yù)期效果。本研究發(fā)現(xiàn),在冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證患者血漿中水平升高的蛋白如結(jié)合珠蛋白、α1-AT均為急性時(shí)相反應(yīng)蛋白。結(jié)合珠蛋白作為一種急性期蛋白,具有多種生物活性,如抗氧化、抗菌及促進(jìn)膽固醇結(jié)晶的潛在作用,其表達(dá)量與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在Heliovaara等的研究中,通過(guò)檢測(cè)21個(gè)健康成人結(jié)合珠蛋白水平發(fā)現(xiàn),該蛋白與血中總膽固醇水平、體質(zhì)指數(shù)、肥胖率及脂質(zhì)氧化代謝異常呈正相關(guān)。而脂質(zhì)過(guò)多沉積是動(dòng)脈粥樣硬化的最重要原因之一。α1-AT是人類血漿中最豐富的蛋白酶抑制因子,是主要的炎性反應(yīng)蛋白之一。α1-AT作用廣泛,在不同的條件下分別表現(xiàn)為抗炎或促炎為主的活性。α1-AT在缺血再灌損傷的急性期表達(dá)增高,被認(rèn)為發(fā)揮抗炎、抗凋亡的作用,是缺血預(yù)適應(yīng)第二時(shí)間窗保護(hù)作用的機(jī)制之一。我們的研究與此一致。據(jù)此推測(cè),冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證可能屬于一種炎癥反應(yīng)。在冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證患者血漿中水平降低的蛋白一部分是對(duì)冠心病有益的載脂蛋白,如載脂蛋白AⅠ、載脂蛋白AⅣ等。載脂蛋白AⅠ是高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL)的主要蛋白成分,而HDL水平與冠心病呈負(fù)相關(guān)。大量臨床和流行病學(xué)研究證實(shí)載脂蛋白AⅠ的降低是心肌梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者發(fā)現(xiàn),冠心病患者載脂蛋白AⅠ水平較高脂血癥患者有明顯的下調(diào)。載脂蛋白AⅣ是一種脂結(jié)合蛋白,載脂蛋白AⅣ的主要作用是參與脂質(zhì)代謝,載脂蛋白AⅣ通過(guò)介導(dǎo)HDL與肝細(xì)胞的結(jié)合以及被攝取,參與了膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。載脂蛋白AⅣ使HDL含量升高并改變其成分,進(jìn)而影響脂蛋白的代謝,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)外排,從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用,也有觀點(diǎn)認(rèn)為載脂蛋白AⅣ可以通過(guò)不依賴于升高HDL的途徑起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。此外,載脂蛋白AⅣ還具有抗炎作用,可以阻止P選擇素介導(dǎo)的白細(xì)胞與血小板之間的粘附。本研究發(fā)現(xiàn),冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證患者血漿中載脂蛋白AⅠ和載脂蛋白AⅣ水平降低,可能是脂代謝紊亂的標(biāo)志。另外,甲狀腺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證患者血漿中水平也降低,它是一種急性時(shí)相負(fù)相蛋白,在機(jī)體內(nèi)起運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素和代謝物等作用,可能是機(jī)體代謝失常的潛在標(biāo)志物。這些微觀物質(zhì)的變化可能是引起冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證患者宏觀表現(xiàn)的原因之一。綜上所述,本研究采用2-DE和MALDI-TOF-MS技術(shù)對(duì)冠心病不穩(wěn)定型心絞痛患者和對(duì)照者去高豐度蛋白血漿進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,建立了相應(yīng)的血漿去高豐度蛋白、雙向電泳、質(zhì)譜鑒定方法,初步發(fā)現(xiàn)了α1-酸性糖蛋白、結(jié)合珠蛋白α1鏈、α1-抗胰蛋白酶、結(jié)合珠蛋白