水通道蛋白4在大鼠腦水腫中的表達(dá)及其意義

水通道蛋白4在大鼠腦水腫中的表達(dá)及其意義

腦出血會(huì)導(dǎo)致大腦損傷和水腫，顱內(nèi)壓會(huì)增加，甚至腦疝。因此,對(duì)腦水腫的診斷和治療一直是臨床探討的重點(diǎn)課題之一。近年來(lái),水通道蛋白-4(AQP4)作為介導(dǎo)腦組織水與電解質(zhì)運(yùn)輸和平衡過(guò)程的重要因子,已引起了廣泛關(guān)注。本研究應(yīng)用出血性腦水腫大鼠模型,通過(guò)免疫組化方法觀察AQP4在腦出血后不同時(shí)間腦組織的分布,探討AQP4與出血性腦水腫之間的內(nèi)在聯(lián)系,為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1各組造模不注膠原酶結(jié)果比較成年健康雄性Wistar大鼠40只,體質(zhì)量250～300g,購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為正常對(duì)照組5只(不做任何處理),假手術(shù)組5只(造模不注膠原酶),出血組:30只,出血后6h、1d、3d、5d、7d每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各6只。多克隆AQP4抗體為美國(guó)Chemicon公司產(chǎn)品,膠原酶VII型由美國(guó)Sigma公司提供,SP試劑盒為北京中山公司產(chǎn)品,其余化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。1.2免疫組化染色1.2.1腦出血模型制作參照Rosenberg等報(bào)道的方法,實(shí)驗(yàn)鼠經(jīng)水合氯醛麻醉后,按包新民等方法將大鼠固定于立體定位儀上,取頭皮正中切口,剝離骨膜,暴露前囟,于前囟后1mm,中線(xiàn)向左旁開(kāi)3mm處鉆一直徑為1mm小孔,用固定于立體定位儀上的微量進(jìn)樣器沿針孔進(jìn)針,進(jìn)針深度為5.9mm,緩慢注射膠原酶1U,注完后留針5min,退針縫合皮膚。術(shù)后觀察神經(jīng)損害的癥狀和體征。模型成功的評(píng)分判斷:大鼠清醒后,按Bederson等的評(píng)定方法分為3級(jí),Ⅰ級(jí):將大鼠尾巴提起,癱瘓側(cè)前肢回收后屈曲于腹下,正常側(cè)前肢向地面伸展;Ⅱ級(jí):除Ⅰ級(jí)體征外,向癱瘓側(cè)推大鼠時(shí)阻力較對(duì)側(cè)明顯降低;Ⅲ級(jí):除以上體征外,大鼠有向癱瘓側(cè)側(cè)旋的行為。1.2.2AQP4免疫組化染色術(shù)后將出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的大鼠隨機(jī)分組,在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)將鼠作常規(guī)灌注固定后取腦,在前囟及前囟后3.5mm將腦切成3部分,進(jìn)行冰凍切片,片厚7μm。免疫組化步驟如下:(1)羊血清封閉,室溫30min;(2)棄去血清,加抗AQP4抗體(1∶600)4℃過(guò)夜;(3)PBS洗3次,每次5min;(4)滴加生物素化羊抗鼠IgG(1∶100)37℃孵育1h;(5)PBS洗3次,每次5min;(6)加SABC底物,室溫孵育1h;(7)PBS洗3次,每次5min;(8)DAB顯色;(9)脫水、透明,中性樹(shù)膠封片。免疫組化染色結(jié)果的判斷:根據(jù)顯色的有無(wú)及強(qiáng)弱綜合評(píng)定,將免疫組化的結(jié)果分為5級(jí):陰性(-):不著色;弱陽(yáng)性(+):淡黃色;陽(yáng)性(++):黃色;中等陽(yáng)性(+++):棕黃色;強(qiáng)陽(yáng)性(++++):為深棕黃色。1.2.3圖像分析在20×10光學(xué)顯微鏡下,觀察每一組動(dòng)物同一部位切片,選擇5個(gè)不重復(fù)視野進(jìn)行觀察,采用北航(CM-2000B)生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)定量分析陽(yáng)性細(xì)胞的平均面積。1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果2.1aqp4表達(dá)見(jiàn)表1。腦組織免疫組化染色結(jié)果顯示,AQP4在血腫周?chē)男切文z質(zhì)細(xì)胞表達(dá),神經(jīng)元未見(jiàn)表達(dá)。AQP4陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物主要表達(dá)在細(xì)胞膜上,強(qiáng)陽(yáng)性時(shí)胞漿有極少量表達(dá),細(xì)胞核不表達(dá)。正常組和假手術(shù)組AQP4表達(dá)呈弱陽(yáng)性,出血組各時(shí)間點(diǎn)AQP4表達(dá)均增強(qiáng),AQP4的表達(dá)強(qiáng)度以腦出血后3d為最高。2.2出血前后d陽(yáng)性細(xì)胞面積的變化腦出血后6h水腫帶AQP4陽(yáng)性細(xì)胞的平均面積開(kāi)始增加,出血后第3d陽(yáng)性細(xì)胞的平均面積最大,此后逐漸下降,出血后第7d陽(yáng)性細(xì)胞面積仍高于正常水平(P<0.05)。3出血側(cè)腦水腫的發(fā)生及病理生理特征AQP4是1994年新發(fā)現(xiàn)的一種水通道蛋白,應(yīng)用Northernblot及Rnase方法測(cè)定的結(jié)果顯示AQP4-mRNA在成熟大腦中含量最高,而在眼、腎、腸及肺含量較少,原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示其mRNA分布于導(dǎo)水管系統(tǒng)的室管膜細(xì)胞、構(gòu)成腦皮質(zhì)邊緣的星形膠質(zhì)細(xì)胞、下丘腦的視上核和室旁核中分泌加壓素的神經(jīng)元,并認(rèn)為其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為滲透壓感受器介導(dǎo)和調(diào)節(jié)水的運(yùn)輸和平衡。已有研究表明,AQP4不僅參與腦組織水代謝的生理和病理過(guò)程,而且可能調(diào)節(jié)腦脊液的形成及細(xì)胞外液容積的變化。若AQP4表達(dá)及調(diào)節(jié)失控,將導(dǎo)致后葉加壓素失調(diào),從而引起自發(fā)性尿崩癥等疾病。Manley等研究AQP4在缺血性腦水腫中的作用,發(fā)現(xiàn)大腦梗死灶邊界區(qū)AQP4過(guò)度表達(dá),而正常鼠腦內(nèi)AQP4低表達(dá),缺乏AQP4的大鼠生存能力強(qiáng),在AQP4低表達(dá)的鼠腦內(nèi)水的容量和星形膠質(zhì)細(xì)胞周?chē)?xì)血管水腫明顯減輕,提示AQP4參與腦水腫的形成。Sato等在缺血性腦水腫的研究也得到類(lèi)似的結(jié)果。這說(shuō)明AQP4在缺血性腦水腫的病理過(guò)程中起關(guān)鍵性作用,然而AQP4在出血性腦水腫的分布目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,正常對(duì)照組、假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組未出血側(cè)大腦AQP4在各時(shí)相點(diǎn)均表達(dá)弱陽(yáng)性,證實(shí)了Agre等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,即在生理?xiàng)l件,水通道基本上是處于激活狀態(tài),水轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程很快,一般不需門(mén)控和其他調(diào)節(jié)。而在腦出血后6h,水腫區(qū)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多,陽(yáng)性細(xì)胞面積增大,AQP4表達(dá)增強(qiáng),第3d達(dá)高峰,此后逐漸回落,但1周后仍明顯高于正常組。除此之外,在出血側(cè)海馬的錐體細(xì)胞層、齒狀回的顆粒細(xì)胞層和多形細(xì)胞層有染色較弱的陽(yáng)性標(biāo)記,這與Venero等用原位雜交法在海馬觀察到的結(jié)果一致。表明在出血性腦水腫的形成過(guò)程中,隨著出血時(shí)間的推移,AQP4的表達(dá)范圍不斷擴(kuò)大,表達(dá)的強(qiáng)度也不斷增加。以上結(jié)果提示:腦出血導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外水及電解質(zhì)平衡失調(diào),細(xì)胞內(nèi)外滲透壓發(fā)生改變,從而激活了位于細(xì)胞膜上的AQP4,使AQP4生物活性增高,促進(jìn)水和電解質(zhì)通過(guò)水通道,導(dǎo)致細(xì)胞水腫。因此,AQP4可能是造成出血性腦水腫的一個(gè)重要因素。Taniguchi等用原位雜交結(jié)合MRI發(fā)現(xiàn),AQP4-mRNA在大腦中動(dòng)脈阻塞后第1d已經(jīng)有弱的上調(diào),在第3d最明顯,第7d后逐漸下降,此時(shí)腦水腫也開(kāi)始消退,這與借助MRI檢測(cè)腦水腫的形成及消退的過(guò)程呈平行關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Taniguchi等的發(fā)現(xiàn)很相似,推測(cè)AQP4在參與缺血性腦水腫和出血性腦水腫的形成過(guò)程中,可能有相同的作用機(jī)制。AQP4分布于下丘腦視上核和室旁核已為大多數(shù)學(xué)者所證實(shí),本研究也觀察到同樣結(jié)果。同時(shí),我們還觀察到在出血側(cè)視上核和室旁核AQP4蛋白的表達(dá)與腦水腫的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。據(jù)Jung等報(bào)道,視上核和室旁核的牽張性離子通道對(duì)細(xì)胞膨脹等容量變化十分敏感,滲透壓改變1%即可發(fā)生反應(yīng),通過(guò)合成和釋放抗利尿加壓素,調(diào)節(jié)腦內(nèi)水與電解質(zhì)的運(yùn)輸和平衡。AQP4作為滲透壓感受器或受體,可以適時(shí)感受和調(diào)節(jié)視上核和室旁核組織內(nèi)滲透壓變化,從而參與抗利尿加壓素的釋放和調(diào)節(jié)。由此可見(jiàn),AQP4在神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)中具有十分重要的功能意義。此外,我們也發(fā)現(xiàn)AQP4還分布于腦表面的軟腦膜、室管膜和脈絡(luò)叢,與腦脊液的重吸收部位一致,推測(cè)腦水腫的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與腦脊液的分泌和吸收障礙密切相關(guān)。然而,AQP4是否位于神經(jīng)元的細(xì)胞膜,至今仍持不同的意見(jiàn)。Yamamoto等通過(guò)體外培養(yǎng)技術(shù),采用RNase和RT-PCR檢測(cè)方法,發(fā)現(xiàn)AQP4僅在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá),神經(jīng)元和其他膠質(zhì)細(xì)胞均未見(jiàn)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果除了發(fā)現(xiàn)AQP4分布在上述部位外,神經(jīng)元亦未見(jiàn)表達(dá),提示在視上核和室旁核表達(dá)AQP