中藥藥理證候動物模型研究進(jìn)展

中藥藥理證候動物模型研究進(jìn)展

中醫(yī)藥的現(xiàn)代化與動物實(shí)驗(yàn)研究密切相關(guān)。中醫(yī)證候動物模型是以中醫(yī)理論為指導(dǎo),對人類疾病原型的某些特征進(jìn)行模擬復(fù)制,創(chuàng)造出的具有人工疾病和證的實(shí)驗(yàn)動物,是有別于西醫(yī)動物模型的獨(dú)具一格的研究方法。從20世紀(jì)60年代開始,在近半個世紀(jì)的時間里,我國共研制出了30余類100多種中醫(yī)證候動物模型,取得了驕人的成績。國內(nèi)外對中藥新藥的研究提出了許多新的要求。如《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》有病(證)133個,其中以證命名的有12項(xiàng),121項(xiàng)以病命名的,病下設(shè)證;《中藥新藥藥理學(xué)研究指南》48個常見病(證)中20個病下設(shè)證,鼓勵病證結(jié)合模型的復(fù)制。這就要求我們在進(jìn)行中藥研究時,根據(jù)新藥功能主治,選用和建立相應(yīng)的中醫(yī)證候動物模型和具有中醫(yī)特點(diǎn)的試驗(yàn)方案。以下就目前中藥研究常用的動物模型的種類、造模因素、特點(diǎn)、存在問題及其與中醫(yī)證型之間的關(guān)系以及今后研究的對策分別簡要加以探討。1分類和性能中醫(yī)動物模型的研究經(jīng)過40余年的發(fā)展,已研制出百余種證型,其造模方法大致可歸納為3種:1.1中醫(yī)證候動物模型又稱為中藥藥理證候動物模型、病因型模型,自上世紀(jì)60年代鄺安堃建立第一個“陽虛”動物模型以來,已用200多種方法,復(fù)制建立了腎虛證、脾虛證、肺虛證、心虛證、血瘀證、血虛證、肝郁證、寒證、熱證、痹證、里實(shí)證、厥脫證、濕阻證、溫病等證候動物模型。此類模型是依據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)理論,以研制開發(fā)“純”中醫(yī)病證動物模型為目的,一般不與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疾病模型相等,造模方法有單因素和復(fù)合因素兩種。優(yōu)點(diǎn)是:造模因素的選擇主要根據(jù)中醫(yī)學(xué)的發(fā)病學(xué)原理來考慮的,模型的病因、癥狀、客觀指標(biāo)和藥物反證比較一致,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與中醫(yī)理論較易吻合,有利于揭示中醫(yī)“證”的實(shí)質(zhì),驗(yàn)證中醫(yī)中藥的療效和機(jī)理,并有可能使中醫(yī)理論和治療手段出現(xiàn)新的突破。缺陷是存在模糊性、簡單性、欠穩(wěn)性。1.2中醫(yī)新藥理研究中的病理損害又稱為中藥藥理疾病動物模型、病理型模型,是在特定的化學(xué)、生物、物理因素或綜合因素刺激下,復(fù)制出西醫(yī)或中醫(yī)病名的動物模型,在造模時重視動物組織、器官或全身的病理損害,目前應(yīng)用最為廣泛。其優(yōu)點(diǎn)是:模型的建立比較成熟,造型方法穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠,重復(fù)性好,與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究結(jié)果有可比性,尤其在中醫(yī)新藥藥理研究中發(fā)揮了較大的作用。故《中藥新藥藥理學(xué)研究指南》中治療45個病證的中藥藥效學(xué)研究仍使用西醫(yī)模型。其不足是:這類造模方法以西醫(yī)的思路來探討中醫(yī)理論,使中醫(yī)處于被解釋的狀態(tài),與中醫(yī)傳統(tǒng)病因不符,使中藥新藥藥理研究缺乏辨證施治的特色,與臨床藥理難相一致,不利于“證”本質(zhì)的研究。1.3建立病證結(jié)合動物模型又稱為中藥藥理病證動物模型、病因病理結(jié)合型模型。這類模型的造模方法是既運(yùn)用了中醫(yī)的發(fā)病學(xué)說,又考慮了西醫(yī)的致病原理,將現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的人類疾病動物模型與中醫(yī)證候動物模型嫁接,建立病證結(jié)合動物模型。如高脂性疾病血瘀證動物模型、失血性貧血血虛證動物模型、感染性休克厥脫證動物模型等。優(yōu)點(diǎn)是:它吸取了中、西醫(yī)在造模的成功經(jīng)驗(yàn),發(fā)揮了各自對某些病證產(chǎn)生的致病特色。既與中醫(yī)理論相聯(lián)系,又與西醫(yī)學(xué)的某些疾病比較一致,有利于中西醫(yī)結(jié)合理論研究的深入發(fā)展。但由于中醫(yī)學(xué)和西醫(yī)學(xué)畢竟是兩個不同的醫(yī)學(xué)體系,兩者之間的接觸點(diǎn)還發(fā)現(xiàn)的不多,聯(lián)合作用機(jī)理尚待完善,故此模型的制作難度較大,目前應(yīng)用也較少。2中醫(yī)與藥理學(xué)的關(guān)系：動態(tài)模式中癥狀的選擇與應(yīng)用2.1中醫(yī)動物模型研究中藥藥理研究必須以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo),研究中藥的藥理、配伍和功效,研究“證”與病理及藥理作用的內(nèi)在聯(lián)系。例如溫心通膠囊,其功效為回陽固本,溫通心脈,臨床適應(yīng)于陽虛型胸痹心痛證。在辨證指導(dǎo)下運(yùn)用對該型冠心病患者有很好的療效。然而吳氏等按《中藥新藥研究指南》中胸痹心痛證中藥藥效學(xué)規(guī)范操作,以異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)動物心肌缺血的方法造模觀察相關(guān)指標(biāo),結(jié)果顯示該藥對實(shí)驗(yàn)性心肌缺血缺氧無保護(hù)作用。這一結(jié)果與中醫(yī)理論及臨床療效極不吻合。深入分析,發(fā)現(xiàn)臨床中該適應(yīng)證除具備心電圖ST段和T波的心肌缺血性病理改變外,還必須具備中醫(yī)陽虛證的定性指標(biāo),因此實(shí)驗(yàn)動物也必須采用陽虛模型大鼠(造模方法也有待研究),這樣才能客觀評價實(shí)驗(yàn)藥物的藥效。可見,以上3種形式的模型是當(dāng)前中醫(yī)動物模型研究的主要類型,各有特色,難以互相取代。應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求進(jìn)行取舍應(yīng)用。每種造模方法都與特異的病理變化相關(guān)聯(lián),都只反映臨床病理的一個方面,其造模方法發(fā)展應(yīng)該是互補(bǔ)型的。新的模型復(fù)制出新的病理,與舊的模型相得益彰,互為補(bǔ)充,而非排斥、取代舊模型。故如果條件允許,可多采用幾種模型,應(yīng)能得到更有力、可靠的結(jié)論。柴氏等研究糖克軟膠囊對不同實(shí)驗(yàn)性動物模型血糖的影響。建立不同的動物模型:靜脈注射四氧嘧啶或腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病胰島細(xì)胞損傷模型;高脂飼料加靜脈注射四氧嘧啶建立糖尿病伴高粘血癥模型;腹腔注射腎上腺素建立應(yīng)激性血糖增高模型;灌服甲狀腺素片和利血平建立陰虛動物模型。結(jié)果證實(shí)糖克軟膠囊對正常大鼠血糖、四氧嘧啶和鏈脲佐菌素致糖尿病大鼠血糖均具有降低作用,但對腎上腺素引起的高血糖影響不明顯,對陰虛小鼠血糖的病理性下降具有對抗保護(hù)作用。結(jié)論認(rèn)為糖克軟膠囊具有明確的降血糖作用,尤其對于高血糖動物作用明顯,其最小有效劑量在0.05~0.1g/kg。除了降血糖作用外,糖克軟膠囊還具有一定的補(bǔ)陰作用,這對糖尿病患者普遍存在的陰虛或許是有利的。2.2造模法的影響苗氏等認(rèn)為中醫(yī)臨床病證是多方面的,為了能更好反映臨床,動物模型最好是采用復(fù)合因素造模。目前用單病因因素或化學(xué)藥品造模法較多,應(yīng)鼓勵雙因素或多因素造模。如導(dǎo)致血瘀證的原因有很多,包括外邪、內(nèi)傷、出血等,而且是各種因素長期相互作用的結(jié)果,故有“久病必瘀”之說。因此單一因素造模難以反映血瘀證的病因病機(jī)。應(yīng)采用多種因素造模,才能較全面反映血瘀證的本質(zhì)。2.3中藥對證的類型進(jìn)行區(qū)分不同致病因素可導(dǎo)致脾氣虛、脾陽虛、脾陰虛等不同亞型的脾虛證,如過勞則傷脾氣;過食生冷或誤下,損傷脾胃;嗜食辛熱或熱性藥物可以傷陰等。因此,易氏認(rèn)為復(fù)制脾虛證動物模型,當(dāng)探索如何復(fù)制出精確的不同亞型的脾虛證模型,以符合臨床實(shí)際并適應(yīng)治療疾病的需要。同樣,在進(jìn)行中藥藥理實(shí)驗(yàn)時,也必須注意精確區(qū)分證和證的亞型。曾氏等在探討保真丸對腎虛模型動物的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制時,分別觀察了大鼠腎陽虛(氫化可的松造模)和腎陰虛(甲狀腺素+利血平造模)兩種證候亞型模型的免疫指標(biāo)變化,得出保真丸對腎虛大鼠具有免疫雙向調(diào)節(jié)作用的結(jié)論。2.4中醫(yī)“證”的變化發(fā)展中醫(yī)的“證”與西醫(yī)的“病”的最大區(qū)別就是“證”包含樸素的時間觀念,是變化的而不是靜止的,是相對的而不是絕對的。同一種疾病在其發(fā)展的不同階段,可以出現(xiàn)多種不同的證,甚至有“同病異證”、“異病同證”和“多證并存”的現(xiàn)象。同一種證受到不同因素的影響,也可以出現(xiàn)不同的發(fā)展變化。如童氏觀察到應(yīng)用大劑量糖皮質(zhì)激素制造虛證模型,早期(前5d)以陰虛為主,以后則轉(zhuǎn)向陽虛。劉氏等觀察到強(qiáng)的松龍造模,早期類似“腎陰虛”,晚期則類似“腎陽虛”。如果在實(shí)驗(yàn)中將模型提供的“證”看作是一成不變的,而隨意給予造模劑量,也不注意造模時間的控制,采取一成不變的造模方法和實(shí)驗(yàn)方法,就忽視了中醫(yī)“證”變化發(fā)展的本質(zhì),也違背了中醫(yī)“證”的概念,將會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗,得出錯誤的結(jié)論。因此,實(shí)驗(yàn)中要密切觀察時間、劑量可能引起的模型證的變化,尋找到模型在一個階段上相對穩(wěn)定的時相點(diǎn)及其時相變化特征,選擇適當(dāng)?shù)膭游?、?yán)格控制劑量及造模時間,及時監(jiān)測以克服模型證容易變化的缺點(diǎn)。2.5嚴(yán)格科學(xué)判定標(biāo)準(zhǔn)模型評價體系是造模過程中必須有的、應(yīng)反復(fù)進(jìn)行的一個內(nèi)容。目前國內(nèi)僅采用癥狀、體征的定性法來衡量模型是否成立,其弊端日益明顯。必須制定嚴(yán)格科學(xué)的判定標(biāo)準(zhǔn),使評定標(biāo)準(zhǔn)體系規(guī)范化,真正做到指標(biāo)量化、客觀化,宏(觀)微(觀)結(jié)合。這樣,才有利于提高科研工作中的準(zhǔn)確性。陳氏認(rèn)為,中醫(yī)動物模型的復(fù)制要從癥狀(體征)、病因(正證)、治療(反證)、相關(guān)因素(佐證)、客觀指標(biāo)(佐證)等多角度來考慮,才能充分體現(xiàn)動物模型與原病證的相似性和典型性。在中藥藥理實(shí)驗(yàn)中也必須堅持模型的評價工作,將之貫穿實(shí)驗(yàn)的始終。2.6選擇對照中藥梁氏認(rèn)為造型動物病理改變的復(fù)雜性、方藥作用機(jī)制的復(fù)雜性以及證與治對應(yīng)關(guān)系的不確定性造成了藥物反證法在邏輯上的不嚴(yán)密,淡化了它的重要作用。因此提出藥物反證應(yīng)堅持對照原則,因?yàn)橛梢唤M方藥對造型動物所作的證的判斷不具排他性,故至少應(yīng)設(shè)2組方藥對同一造型動物進(jìn)行對比觀察。同時反證方藥應(yīng)力求標(biāo)準(zhǔn)化。目前選用的測證藥物均屬自定,有經(jīng)典方,如四君子湯、理中湯等,也有自擬方。在選擇對照方藥時,可以選擇與治療藥物同屬一種治法(治則)的方藥為一個對照;再按照證與證之間的邏輯關(guān)系選定另一種治法(治則)的方藥為另一個對照,如旨在明確某種動物模型為氣虛證,在運(yùn)用補(bǔ)氣劑反證時,其對照方藥應(yīng)為補(bǔ)血劑,借以排除該證不是血虛證。目前許多中藥藥理實(shí)驗(yàn)常設(shè)置一陽性藥物對照組,既起到藥物反證的作用,又可以作為陽性對照。但從時序上說,應(yīng)該先進(jìn)行藥物反證確定造模成功后,再用陽性藥物對照驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)藥物的藥效,盡管為實(shí)現(xiàn)這兩種目的選用的可以是同一種藥物或方劑。因此可嘗試在造模前先對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行體質(zhì)分類,然后再造模,之后再運(yùn)用藥物反證和比較篩選法對不同體質(zhì)的造模動物進(jìn)行中醫(yī)證候?qū)傩缘恼J(rèn)定。陳氏在進(jìn)行脾氣虛證動物規(guī)范化造模研究時就運(yùn)用了體質(zhì)篩選法。由于中醫(yī)證候和體質(zhì)的聯(lián)系,根據(jù)游泳時間的長短,將游泳時間較短、具有(脾)氣虛潛質(zhì)的動物分在模型組,使其更易成模。實(shí)驗(yàn)設(shè)計時將體質(zhì)作為一個控制因素,可以消除體質(zhì)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。如作隨機(jī)區(qū)組設(shè)計,可將體質(zhì)相近的動物分在同一個區(qū)組,再在區(qū)組內(nèi)隨機(jī)分配不同的處理。2.8對不同動物胃粘膜病理組織學(xué)改變的療效分析對照研究應(yīng)設(shè)正常對照和模型組,以判斷模型制作是否成功;還可設(shè)自然恢復(fù)組,以進(jìn)一步驗(yàn)證證候模型的成立和治療組的療效。范氏等采用2%水楊酸鈉灌胃及饑飽勞倦因素結(jié)合的方法,復(fù)制了大白鼠脾氣虛型慢性萎縮型胃炎(簡稱CAG)病證結(jié)合模型,分為單純造模組和自然恢復(fù)組,觀察胃炎克方對于模型動物胃粘膜病理形態(tài)學(xué)改變的治療作用。結(jié)果表明,胃炎克方可明顯減輕模型動物胃粘膜炎癥細(xì)胞浸潤程度,增加主、壁細(xì)胞及胃竇G細(xì)胞數(shù)量,可使變性壁細(xì)胞修復(fù),其療效明顯優(yōu)于自然恢復(fù)組。自然恢復(fù)組病變修復(fù)程度不及治療組,與單純造模組無顯著差異?？傊?在實(shí)驗(yàn)過程中,應(yīng)詳細(xì)考察動物特性及受環(huán)境