大鼠雙側(cè)腎上腺切除術(shù)后下丘腦室旁核mr、gr表達(dá)的變化

大鼠雙側(cè)腎上腺切除術(shù)后下丘腦室旁核mr、gr表達(dá)的變化

干預(yù)神經(jīng)因素的遺傳因素（hyp-a）是調(diào)節(jié)身體和環(huán)境平衡、維持和調(diào)節(jié)身體衰老過(guò)程的重要因素。糖皮質(zhì)激素與皮質(zhì)類固醇激素受體——鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoidreceptor,MR)和糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoidreceptor,GR)結(jié)合,反饋?zhàn)饔糜诖贵w和下丘腦構(gòu)成HPA軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)的主要通路。其中下丘腦室旁核(periventricularnucleus,PVN)有直接激活HPA軸的作用,是HPA軸的調(diào)節(jié)中心。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠腎上腺切除模型,應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察了腎上腺切除后大鼠下丘腦室旁核MR、GR的表達(dá)變化,為進(jìn)一步研究MR、GR在調(diào)節(jié)HPA軸中發(fā)揮的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組成年健康雄性Wistar大鼠70只,體重200～220g,中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)室條件飼養(yǎng),隨機(jī)分正常組、腎上腺切除0,4,7d組及假手術(shù)組。每組10只。1.2小鼠肝腎損傷前引物前充液將大鼠用戊巴比妥麻醉后,取俯臥位固定于蛙板上。從最后胸椎處向后沿背部正中線做約2cm長(zhǎng)的皮膚切口。在腎臟前內(nèi)側(cè)脊柱下方找到淡黃色的腎上腺并摘除,同法摘除右側(cè)腎上腺(位置稍靠前),縫合肌肉和皮膚,并涂以碘酊。對(duì)照組進(jìn)行與實(shí)驗(yàn)組相似的手術(shù),但不摘除腎上腺。術(shù)后保持室溫為21～25℃,以葡萄糖液、生理鹽水代替飲水。1.3抗組織化學(xué)染色各組大鼠稱體重后,腹腔內(nèi)注射戊巴比妥麻醉,打開胸腔,從左心室插管至升主動(dòng)脈,剪開右心耳,生理鹽水快速?zèng)_洗后,4%的多聚甲醛灌流固定,取腦組織在同種固定液中續(xù)固定3h,40%的蔗糖沉糖,制作冰凍切片,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。1.4抗mr、gr抗體恒冷箱切片機(jī)(型號(hào)Leica)制作冰凍切片,厚14μm,0.01MPBS漂洗后切片依次經(jīng)0.03%Tritonx-100浸泡10min、3%H2O2-甲醇20min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、5%BSA封閉20min后滴加兔抗MR、GR抗體(MR工作濃度為1∶200、GR工作濃度為1∶500MR、GR均購(gòu)于SantaCruzBiotechnology公司),4℃冰箱孵育過(guò)夜,(對(duì)照組加0.01MPBS代替一抗)再滴加生物素化羊抗兔IgG和即用型SABC(免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司),以上各步間用0.01MPBS漂洗,DAB顯色,脫水,透明,封片,光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS,BX60,Japan)下觀察并攝片。1.5平均光密度測(cè)定采用MoticImagesAdvanced3.2圖像分析系統(tǒng),在下丘腦室旁核區(qū)測(cè)每高倍(10×40倍)視野內(nèi)MR、GR的光密度值,每張切片選2～3個(gè)視野,計(jì)算各組平均光密度(IOD)。所得數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理,采用方差分析進(jìn)行兩兩比較,以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1室旁核神經(jīng)元/細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的產(chǎn)物正常組、假手術(shù)組及腎上腺切除組MR免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色表達(dá),位于室旁核神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。各組免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目及染色強(qiáng)度無(wú)明顯變化(P>0.05)(表1、圖1)。2.2gr免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目、染色強(qiáng)度的比較GR免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色表達(dá),正常組、假手術(shù)組的GR主要分布在室旁核神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中。腎上腺切除組:0d組GR免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目、染色強(qiáng)度與正常組、假手術(shù)組相比,無(wú)顯著性差異(P>0.05)。4,7d組GR免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較正常組、假手術(shù)組明顯增多,染色深(P<0.05),免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,7d組較4d組免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞多,染色更深,表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)(表2、圖2)。腺切除4d組比較**P<0.05。。3糖皮質(zhì)與糖激素的作用下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)由下丘腦、垂體、腎上腺組成,三者構(gòu)成一種級(jí)別上的相互協(xié)調(diào)的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)。下丘腦的室旁核(PVN)是HPA軸活動(dòng)的直接控制部位。當(dāng)下丘腦接受來(lái)自高位中樞信息時(shí),PVN的小細(xì)胞神經(jīng)元分泌多種促進(jìn)促腎上腺皮質(zhì)激素分泌的激素,其中最重要的是促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)和精氨酸加壓素(AVP)。CRH和AVP經(jīng)垂體門脈血流到達(dá)垂體,并刺激垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH);后者經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)腎上腺,刺激腎上腺皮質(zhì)合成和分泌糖皮質(zhì)激素(靈長(zhǎng)類動(dòng)物以皮質(zhì)醇為主,嚙齒類動(dòng)物以皮質(zhì)酮為主)。糖皮質(zhì)激素與皮質(zhì)類固醇激素受體-鹽皮質(zhì)激素受體(MR)和糖皮質(zhì)激素受體(GR)結(jié)合,反饋?zhàn)饔糜诖贵w和下丘腦構(gòu)成HPA軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)的主要通路。MR、GR這兩個(gè)受體屬于核受體家族,他們是能與特異性激素結(jié)合的蛋白,主要是一類配基依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)誘導(dǎo)或者抑制細(xì)胞的增殖、分化和死亡,導(dǎo)致多種生物效應(yīng)。核受體的最大特點(diǎn)是未與激素結(jié)合前位于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)受體和激素結(jié)合后導(dǎo)致受體的活化,活化的受體發(fā)生核轉(zhuǎn)位,使受體由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。MR在中樞的表達(dá)比較集中,主要局限在海馬、外側(cè)隔核、杏仁核、嗅核、穹窿下器官、下丘腦等區(qū)域。GR廣泛分布于大腦各區(qū),以邊緣系統(tǒng)的海馬、隔區(qū)、下丘腦最為豐富。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)了正常組、假手術(shù)組及腎上腺切除0,4,7d組下丘腦室旁核MR、GR的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,腎上腺切除后下丘腦室旁核MR的表達(dá)無(wú)顯著變化,而GR表達(dá)上調(diào)。并且GR的免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。這種結(jié)果說(shuō)明位于下丘腦室旁核的MR可能沒(méi)有直接涉及HPA軸的調(diào)節(jié)。曾有報(bào)道,海馬的MR與糖皮質(zhì)激素結(jié)合,參與HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié),杏仁核、前額皮質(zhì)的MR與糖皮質(zhì)激素結(jié)合可以激活HPA軸。我們推測(cè)MR在各個(gè)腦區(qū)的作用是不同的,下丘腦室旁核MR與皮質(zhì)酮結(jié)合的作用可能是對(duì)水鹽攝取和血壓的調(diào)節(jié)。腎上腺切除后GR的表達(dá)升高,部分神經(jīng)元免疫反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)主要分布在胞質(zhì),表明腎上腺切除后糖皮質(zhì)激素水平下降或缺