冠心病心絞痛患者尿液代謝組學(xué)研究

冠心病心絞痛患者尿液代謝組學(xué)研究

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是一種由冠狀動(dòng)脈供血不足、急性肌腱缺如和缺氧引起的臨床綜合征。屬于中醫(yī)學(xué)的胸悶和胸痛范疇。通過(guò)對(duì)5099例冠心病心絞痛病例的57種證候類型研究表明,單因素證候中血瘀最多,其他依次為痰濁、陽(yáng)虛、氣虛、寒凝、血虛。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等之后發(fā)展起來(lái)的以探討機(jī)體整體代謝狀態(tài)為目標(biāo)的新方法。疾病引起的機(jī)體代謝水平紊亂往往會(huì)在尿液和血液等體液的代謝組得到表現(xiàn)。因此,對(duì)尿液和血液等體液代謝組進(jìn)行檢測(cè)和分析,就有可能對(duì)疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程伴隨的生物化學(xué)變化進(jìn)行了解和認(rèn)識(shí),有可能發(fā)現(xiàn)相關(guān)疾病發(fā)生的早期代謝組標(biāo)志物簇并認(rèn)識(shí)相關(guān)的病理發(fā)生的分子機(jī)理,有可能對(duì)疾病在其早期甚至發(fā)生之前進(jìn)行診斷。本研究利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)冠心病心絞痛痰濁證、血瘀證進(jìn)行了初步研究,試圖通過(guò)患者尿液代謝物質(zhì)的變化探索病證模式背后的生物標(biāo)記物。1研究主題1.1療效判定標(biāo)準(zhǔn):自然組和臨床組選擇2008年12月~2009年9月在南方醫(yī)院心內(nèi)科患冠心病心絞痛(穩(wěn)定型、不穩(wěn)定型)的住院病人,經(jīng)選擇性冠狀動(dòng)脈造影確認(rèn)為冠心病,經(jīng)主任中醫(yī)師辨證為痰濁證的患者12例,血瘀證12例。健康對(duì)照組為6例通過(guò)體檢確定其身體健康的志愿者,無(wú)痰濁證、血瘀證表現(xiàn)。3組性別、年齡經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。1.2中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)冠心病心絞痛診斷標(biāo)準(zhǔn):參照國(guó)際心臟病學(xué)會(huì)和協(xié)會(huì)及世界衛(wèi)生組織臨床命名標(biāo)準(zhǔn)化聯(lián)合專題組報(bào)告《缺血性心臟病的命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)》,并經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診。痰濁證診斷標(biāo)準(zhǔn)。舌脈:舌苔胖大,邊有齒痕,苔濁膩或白滑,脈滑或數(shù)。主癥:心胸悶痛痞滿,胸悶重而心痛微。次癥:口黏乏味,納呆脘脹,頭身困重,痰多體胖。由主任中醫(yī)師辨證入組。血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)。舌脈:舌紫暗,舌有瘀斑,舌下絡(luò)脈青紫,苔薄,脈弦澀或結(jié)代。主癥:心胸疼痛,如刺如絞,痛有定處,入夜為甚。次癥:怔忡不寧,面色晦暗,唇青紫,發(fā)枯膚燥。1.3并發(fā)癥的發(fā)生不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者;急性心肌梗死、心肌炎、心臟神經(jīng)官能癥、肋間神經(jīng)痛;其他疾病引起的心絞痛,如風(fēng)濕熱、梅毒、先天性冠狀動(dòng)脈畸形、肥厚型心肌病、主動(dòng)脈瓣狹窄或關(guān)閉不全者;合并有腦中風(fēng)、糖尿病、肺部感染、腎炎、腎功能衰竭、泌尿系感染、風(fēng)濕病、肝、腎、造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病及骨關(guān)節(jié)病者;妊娠期或哺乳期患者,過(guò)敏體質(zhì)患者。2學(xué)習(xí)方法2.1%重水de儀器:美國(guó)瓦里安公司(Varian,Inc.)INOVA500MHz超導(dǎo)核磁共振譜儀,配備脈沖場(chǎng)梯度,帶梯度場(chǎng)的三共振探頭;離心機(jī):德國(guó)EppendorfMiniSpinPlus。試劑:重水(D2O),美國(guó)CambridgeIsotopeLaboratories,Inc.公司,99.9%;氘代氯仿,美國(guó)CambridgeIsotopeLaboratories,Inc.公司,99.8%;氘代甲醇,美國(guó)CambridgeIsotopeLaboratories,Inc.公司,99.8%;3-三甲基硅烷基-2,2,3,3-四氘代丙酸鈉(TSP),德國(guó)Merck公司。2.2尿液及上清液2.2.1取材與處理冠心病患者于入院第2天(治療前)取清晨空腹時(shí)尿液5mL,經(jīng)13000r/min離心10min。取上清3ml分裝,-80℃保存。健康人也取清晨空腹時(shí)尿液,方法同上。2.3光譜積分方法尿液在室溫中解凍,取500μl上清加入250μl緩沖液(0.2mol/LNa2HPO4/NaH2PO4,pH=7.4),放置10min,4℃,13000r/min離心10min。取上清液500μl,添加100μl的TSP(1mg/ml)混勻,轉(zhuǎn)入5mm核磁管中進(jìn)行測(cè)試。采用有預(yù)飽和的1DNOESY脈沖序列,取如下參數(shù):譜寬8000Hz,混合時(shí)間0.15s,馳豫延遲時(shí)間2s,采樣點(diǎn)數(shù)32k,累加次數(shù)64次;在馳豫延遲和混合期間采用預(yù)飽和方式抑制水峰,譜儀偏置設(shè)置在水峰的位置。自由感應(yīng)衰減信號(hào)經(jīng)過(guò)填零為64k點(diǎn)之后,再加上0.5Hz的線增寬因子,經(jīng)傅立葉變換轉(zhuǎn)換為NMR圖譜。以TSP為化學(xué)位移參考峰,設(shè)此為0ppm。用MNOVA軟件將所得譜圖進(jìn)行基線校正和相位調(diào)整,對(duì)0.4ppm~9.4ppm的范圍進(jìn)行分段積分,每段為0.04ppm,同時(shí)排除包含溶劑峰和尿素峰的部分(4.6ppm~6.2ppm)。將積分按每張譜的總積分強(qiáng)度歸一化。所得數(shù)據(jù)輸出并轉(zhuǎn)換到Excel文件保存。2.4多元統(tǒng)計(jì)分析將保存的Exeel格式數(shù)據(jù)輸入到SIMCA-P+軟件(vl0.5,Umetrics,Umea,Sweden)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用平均中心化或pareto標(biāo)度化進(jìn)行預(yù)處理之后,采用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)。3結(jié)果3.13各組1h-nmr模式冠心病心絞痛痰濁證、冠心病心絞痛血瘀證組尿液樣品的典型1H-NMR圖譜如下:3.21積分值分布情況冠心病心絞痛痰濁證組與血瘀證組尿液樣本的1H-NMR譜的PLS-DA分析結(jié)果見(jiàn)圖2。從積分圖可見(jiàn),主成分積分值集中分布于橢圓形散點(diǎn)圖(95%置信區(qū)內(nèi))的4個(gè)區(qū)域,2組間無(wú)明顯交叉和重疊。對(duì)1H-NMR譜變化值影響最大的2個(gè)主成分對(duì)累積方差的貢獻(xiàn)率為80.3%。積分圖上2組樣本間沿t軸方向能較好地分開(kāi),說(shuō)明組間差異顯著。因子載荷圖結(jié)合原始圖譜可以找出差異代謝物的NMR峰化學(xué)位移值,2組尿液樣本中差異性代謝物見(jiàn)表1。3血糖代謝相關(guān)化合物變化,易導(dǎo)致腎功能損害從1H-NMR圖譜及模式識(shí)別分析發(fā)現(xiàn),二組血漿樣本之間存在顯著的代謝產(chǎn)物譜差異:①2組的差異代謝物中與能量代謝有關(guān)的化合物有檸檬酸、α-酮戊二酸、順式-烏頭酸。檸檬酸與α-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,順式-烏頭酸是檸檬酸在烏頭酸酶作用下異構(gòu)化生成異檸檬酸的中間產(chǎn)物。痰濁證組上述物質(zhì)含量較高,血瘀證組較低,提示可能痰濁證組三羧酸循環(huán)的能量代謝水平高于血瘀證組;②差異代謝物中與糖代謝有關(guān)的化合物有β-葡萄糖。痰濁證組尿液中的葡萄糖含量高于血瘀證組,提示可能痰濁證組比血瘀證組存在更嚴(yán)重的糖代謝紊亂;③差異代謝物中與脂代謝有關(guān)的化合物有3-羥基丁酸、丙酮。3-羥基丁酸與丙酮都屬于酮體,酮體是脂肪分解的產(chǎn)物,糖代謝障礙和脂肪不完全氧化時(shí)酮體在體內(nèi)積聚使血酮升高,多余的酮體經(jīng)尿排出。痰濁證組的尿酮體含量比血瘀證組高,提示可能由于糖代謝紊亂導(dǎo)致的繼發(fā)性脂肪代謝紊亂比血瘀證嚴(yán)重;④差異代謝物中與氨基酸代謝有關(guān)的化合物有酪氨酸、組氨酸,二者均為非必需氨基酸。酪氨酸在促進(jìn)能量代謝、清除自由基、延緩疲勞等方面均有積極作用。組氨酸在人體中是組胺的前體,組胺能擴(kuò)張血管,降低血壓。痰濁證組的酪氨酸含量比血瘀證組高,組氨酸含量比血瘀證組低,可能提示血瘀證組氧自由基的增加與血管收縮比痰濁證組嚴(yán)重;⑤與腎功能變化相關(guān)的化合物有肌酐、氧化三甲胺。尿肌酐主要來(lái)自血液,經(jīng)過(guò)腎小球過(guò)濾后隨尿液排除體外,腎小管基本不吸收且排出很少。對(duì)于腎功能下降的患者而言,尿肌酐測(cè)定與血肌酐剛好相反,尿肌酐越高,一般說(shuō)明腎臟排除肌酐毒素的功能越強(qiáng)。冠心病患者常同時(shí)合并高血壓和糖尿病,而后兩者常累及腎臟導(dǎo)致腎功能受損;同時(shí)冠心病患者也常伴有腎動(dòng)脈粥樣硬化,引起頑固性腎血管性高血壓、腎組織梗死以及動(dòng)脈粥樣硬化性固縮腎,從而導(dǎo)致腎功能下降。氧化三甲胺是一種反映腎臟問(wèn)題的生物標(biāo)志物,有促進(jìn)肌肉組織生長(zhǎng)的作用。痰濁證組尿液肌酐、TMAO含量比血瘀證組高,可能提示血瘀證組比痰濁證組更容易出現(xiàn)腎功能損害;⑥與肝膽、胃腸功能變化相關(guān)的化合物有膽汁酸、二甲胺、馬尿酸。膽汁酸作為膽汁的主要成分,可以反映肝臟分泌、肝臟合成與代謝、肝細(xì)胞損害的情況。一般而言,血中膽汁酸增高則尿中膽汁酸增高,提示肝功能受損。痰濁證尿液中尿膽汁酸含量較高,提示血瘀證組比痰濁證組更容易出現(xiàn)肝功能損害。二甲胺和馬尿酸來(lái)自于消化道微生物產(chǎn)生的腐敗產(chǎn)物,二者含量升高反映腸道微生物菌群的失調(diào),腐敗產(chǎn)物的增加可能是一些腸道疾病的原因。痰濁證組尿二甲胺和馬尿酸含量較高,提示痰濁證比血瘀證組更容易出現(xiàn)胃腸功能紊亂。既然心絞痛證型與腎肝膽脾胃功能有關(guān),正所謂“五臟六腑皆令心痛,非獨(dú)心也”,那么心痛病本在心,法當(dāng)調(diào)治本臟;若與其他臟腑有關(guān),法當(dāng)明辨標(biāo)本,調(diào)治相關(guān)臟腑;⑦本次試驗(yàn)未解決的問(wèn)題是,血瘀證組在化學(xué)位移為0.60、0.48、0.40、0.44、8.80、9.24ppm處的未知化合物含量明顯高于痰濁證組。冠心病心絞痛2種證型的尿液1H-NMR圖譜能被區(qū)分