基因組文庫的構(gòu)建

第六章DNA文庫的構(gòu)建和

目的基因的篩選

對于高等真核生物而言，基因組DNA十分龐大,基因可達(dá)數(shù)萬個，且基因組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除編碼序列，還有非編碼序列及調(diào)控序列，基因間還存在大量的間隔序列和重復(fù)序列，因此，單個目的基因在整個基因組中所占的比例極其微小，除少數(shù)例外，絕大多數(shù)基因難以直接分離得到。為了解決這個難題，一種可行的方法就是將這個基因擴(kuò)增，增加成功分離目的基因的可能性。但是由于要分離的目的基因往往是未知基因，因此無法對它進(jìn)行特異性擴(kuò)增，只能構(gòu)建該生物材料的基因文庫，然后再根據(jù)不同的方法將所需的克隆篩選出來，最后分離得到目的基因?；蚪M文庫(Genomiclibrary)：是指將某種生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽性菌落，這個群體就稱為該生物基因組文庫。其目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因。第一節(jié)基因組DNA文庫的構(gòu)建一、基因組DNA文庫的類型根據(jù)所選用的載體可以分為：質(zhì)粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、人工染色體文庫（細(xì)菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫）。二、基因組DNA文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一個理想的基因組DNA文庫應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長度，避免基因被分隔克隆克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序克隆片段易于從載體分子上完整卸下重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選三、基因組DNA文庫構(gòu)建的程序

①載體DNA的制備；②高純度大相對分子質(zhì)量基因組DNA的提取和大片段的制備；③高純度大相對分子質(zhì)量基因組DNA的部分酶切與脈沖電泳分級分離；④載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；⑤重組克隆的挑選和保存。基因組DNA文庫限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝四、生物基因組DNA文庫的構(gòu)建（一）生物基因組DNA的提取染色體DNA

（二）基因組DNA的不完全酶切1、根據(jù)實驗需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶a)四個識別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率:1/256b)六個識別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率:1/10242、分離目的酶切片段大小的確定a)克隆單個基因：<10kbb)克隆基因族：<20kb3、DNA不完全酶切條件的確定a)確定限制酶用量，改變酶切時間b)固定酶切時間，改變限制酶的用量DNA的不完全酶切（三）酶切片段與克隆載體連接１、酶切片段的分離與純化１）低熔點(diǎn)瓊脂糖回收目的片段２）試劑盒回收目的片段2、酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇a）質(zhì)粒載體可承載15kbDNA左右片段(有效的范圍為<10kb)b）載體可承載25kbDNA左右片段(有效的范圍為15kb)c）Cosmid載體可承載45kbDNA左右片段(有效的范圍為<40kb)（四）重組ＤＮＡ轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞１、根據(jù)克隆載體的性質(zhì)選擇合適的受體細(xì)胞常見的宿主細(xì)胞：DH5

:用于鋪制與培養(yǎng)質(zhì)粒平板和粘粒平板的重組缺陷型的抑制型菌株，可與pUC編碼的－半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)

互補(bǔ)。HB101:用于大規(guī)模制備質(zhì)粒的抑制型菌株，轉(zhuǎn)化效率高JM101:可支持帶有琥珀突變載體生長的宿主