DB36T1846-2023家畜化膿隱秘桿菌病診斷技術(shù)規(guī)范

ICS11.220CCSB41

DB36江 西 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB36/T1846—2023家畜化膿隱秘桿菌病診斷技術(shù)規(guī)范DiagnosticspecificationsforTrueperellapyogenesdiseaseinlivestock2023-09-182023-09-18發(fā)布2024-03-01實(shí)施江西省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布DB36/T1846DB36/T1846—2023前??言本文件按照《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1本文件由江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口；本文件起草單位：江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、贛州市畜牧業(yè)發(fā)展和動(dòng)物疫病防控中心。本文件主要起草人：譚美芳、楊群、曾艷兵、李海琴、季華員、譚佳、張帆帆、方紹培、黃美峰、吳誠(chéng)誠(chéng)、饒煜玲。IIDB36/T1846DB36/T1846—2023DB36/T1846—20234.2器材器材按GB/T4789.6-2003DB36/T1846—20234.2器材器材按GB/T4789.6-2003中3的規(guī)定準(zhǔn)備。5臨床診斷家畜化膿隱秘桿菌病診斷技術(shù)規(guī)范范圍本文件適用于牛、羊、豬等家畜化膿隱秘桿菌病的診斷、檢疫及流行病學(xué)調(diào)查。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。凡是注日期的引用文件，（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T4789.6-2003 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)GB/T4789.28 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB19489 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541 獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1化膿隱秘桿菌Trueperellapyogenes3.2化膿隱秘桿菌病Trueperellapyogenesdisease4試劑與器材試劑GB/T4789.28的要求實(shí)施。PCRGB/T4789.6-20034章的規(guī)定準(zhǔn)備。1流行病學(xué)臨床癥狀化膿性肺炎病畜體溫升高，食欲減退，伴有咳喘、流涕、呼吸急促等呼吸道癥狀，漸進(jìn)性消瘦。子宮內(nèi)膜炎化膿性關(guān)節(jié)炎病畜精神沉郁，采食量下降，關(guān)節(jié)腫脹，跛行或不能站立。皮下或肌肉膿腫化膿性關(guān)節(jié)炎病畜精神沉郁，采食量下降，關(guān)節(jié)腫脹，跛行或不能站立。皮下或肌肉膿腫頰部、淋巴結(jié)等部位可見(jiàn)大小不等的膿包。病理學(xué)變化化膿性肺炎子宮內(nèi)膜炎剖檢可見(jiàn)子宮體積增大，宮頸口不同程度的腫脹和充血，宮腔內(nèi)有膿液，子宮內(nèi)膜有糜爛或潰瘍?cè)?。化膿性乳房炎剖檢可見(jiàn)乳腺組織內(nèi)有大小不等的化膿灶，彌散分布，充滿(mǎn)黃白色或黃綠色的膿性滲出物?；撔躁P(guān)節(jié)炎剖檢可見(jiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)有膿汁，關(guān)節(jié)軟骨上有黃色干酪樣物。25.3.5皮下或肌肉膿腫病原菌的分離培養(yǎng)樣品的采集、保存與運(yùn)輸分泌物、膿汁、乳汁、組織等病料樣品的采集、保存與運(yùn)輸按照NY/T541的要求執(zhí)行。細(xì)菌分離培養(yǎng)接種菌落形態(tài)觀察7病原菌的鑒定鏡檢革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)莢膜，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛，散在分布，形態(tài)不均一的棒狀短桿菌。生化鑒定生化試驗(yàn)6.2.2GB4789.2837℃恒溫培養(yǎng)18h~24h7病原菌的鑒定鏡檢革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)莢膜，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛，散在分布，形態(tài)不均一的棒狀短桿菌。生化鑒定生化試驗(yàn)6.2.2GB4789.2837℃恒溫培養(yǎng)18h~24h。生化特性記錄生化試驗(yàn)結(jié)果。表1化膿隱秘桿菌生化反應(yīng)結(jié)果3生化試驗(yàn)項(xiàng)目反應(yīng)結(jié)果生化試驗(yàn)項(xiàng)目反應(yīng)結(jié)果葡萄糖+甘露醇－蔗糖－尿素－乳糖+甲基紅+半乳糖+吲哚－麥芽糖+硝酸鹽－棉籽糖－觸酶－果糖+VP－DB36/T1846—20237.2.3結(jié)果判定若疑似菌落的生化特性與標(biāo)準(zhǔn)化膿隱秘桿菌生化特性（表1）一致，可確認(rèn)該菌為化膿隱秘桿菌。PCR鑒定模板制備細(xì)菌基因組模板的制備方法，按GB/T4789.6的規(guī)定執(zhí)行。引物序列檢測(cè)基因是化膿隱秘桿菌保守的特異性基因plo（溶血素編碼基因）。上游引物序列：5'-GGCCCGAATGTCACCGC-3'；下游引物序列：5'-AACTCCGCCTCTAGCGC-3'。擴(kuò)增片段大小為270bp。反應(yīng)體系每個(gè)樣品建立25μLPCR反應(yīng)體系，見(jiàn)表2。用化膿隱秘桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC19411）的基因組作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌雙蒸水作為陰性對(duì)照。表2化膿隱秘桿菌plo基因擴(kuò)增體系配置表試劑名稱(chēng)加樣體積（μL）2×TaqPCRMasterMix12.5上游引物（10μmol/L）1下游引物（10μmol/L）1DNA模板2滅菌去離子水8.5PPCR循環(huán)條件預(yù)變性95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，結(jié)束反應(yīng)，4℃保存。PCR產(chǎn)物電泳配制1.5%5μLPCRDNAmarker作為分子量參考。用凝膠成像系統(tǒng)觀察分析電泳結(jié)果。結(jié)果判定陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出270bp的條帶，同時(shí)陰性對(duì)照未見(jiàn)有PCR擴(kuò)增條帶，檢測(cè)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)與陽(yáng)性質(zhì)控同樣大小的條帶時(shí)，判為陽(yáng)性；被檢樣品未出現(xiàn)與陽(yáng)性質(zhì)控同樣大小的條帶時(shí)，判為陰性。