定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)課件

細(xì)胞工程教研室第九章定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)

石曉衛(wèi)E-mail：xwshi205@126.com細(xì)胞工程教研室第九章定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)細(xì)胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)定量蛋白質(zhì)組學(xué)是指把一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜的混合體系中的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量和鑒定。這一概念的提出標(biāo)志著蛋白質(zhì)組技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善。蛋白質(zhì)組學(xué)研究已從對(duì)蛋白質(zhì)簡(jiǎn)單的定性向精確的定量方向發(fā)展。細(xì)胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)定量蛋白質(zhì)組學(xué)是指把一個(gè)基因組表細(xì)胞工程教研室細(xì)胞工程教研室細(xì)胞工程教研室主要內(nèi)容

定量技術(shù)體系與分類熒光染料分析法同位素標(biāo)記技術(shù)針對(duì)性親和標(biāo)簽技術(shù)同位素標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用細(xì)胞工程教研室主要內(nèi)容定量技術(shù)體系與分類細(xì)胞工程教研室一定量技術(shù)體系和分類

技術(shù)體系雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)體系蛋白質(zhì)芯片分析體系基于同位素標(biāo)記的質(zhì)譜分析技術(shù)體系細(xì)胞工程教研室一定量技術(shù)體系和分類技術(shù)體系細(xì)胞工程教研室2-DE-MS技術(shù)體系無(wú)標(biāo)記的蛋白質(zhì)雙向電泳熒光差異凝膠電泳基于同位素標(biāo)簽和自動(dòng)化的串聯(lián)質(zhì)譜細(xì)胞工程教研室2-DE-MS技術(shù)體系細(xì)胞工程教研室定量分析方法定性差異分析和定量差異分析絕對(duì)定量和相對(duì)定量凝膠差異分析和非凝膠差異分析標(biāo)記定量法和無(wú)標(biāo)記定量法細(xì)胞工程教研室定量分析方法定性差異分析和定量差異分析細(xì)胞工程教研室二熒光染料分析法雙向電泳（2-DE）凝膠染料顯示考馬斯亮藍(lán)銀染熒光染色熒光標(biāo)記細(xì)胞工程教研室二熒光染料分析法雙向電泳（2-DE）凝膠染細(xì)胞工程教研室

熒光雙向差異凝膠電泳（2D-DIGE）目前，在傳統(tǒng)2-DE技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展出的2D-DIGE，采用專有的熒光染料（Cy2、Cy3、Cy5）與多重樣本和圖象分析的方法，在同一塊膠上可同時(shí)分離多個(gè)由不同熒光標(biāo)記的樣品，并以熒光標(biāo)記的樣品混合物為內(nèi)標(biāo)，對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)和每個(gè)差異都可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)可信度分析，從而具有良好的重復(fù)性和較高的準(zhǔn)確率。另外，由于熒光染料的使用，使得2D-DIGE具有高靈敏度的特性，能夠滿足高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析的要求。細(xì)胞工程教研室熒光雙向差異凝膠電泳（2D-DIGE）目前，細(xì)胞工程教研室細(xì)胞工程教研室細(xì)胞工程教研室熒光掃描儀細(xì)胞工程教研室熒光掃描儀細(xì)胞工程教研室細(xì)胞工程教研室細(xì)胞工程教研室三同位素標(biāo)記技術(shù)原理

多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)譜響應(yīng)值受許多難以控制的因素的影響，特別是其離子化效率受其他物質(zhì)和條件的影響很大，具有很強(qiáng)的體系依賴性，因而不能對(duì)來(lái)自相同肽段兩次質(zhì)譜檢測(cè)得到的信號(hào)強(qiáng)度像色譜定量中那樣進(jìn)行比較定量。細(xì)胞工程教研室三同位素標(biāo)記技術(shù)原理細(xì)胞工程教研室一個(gè)肽的惟一適合的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)記有穩(wěn)定同位素的同一個(gè)肽。所以，在完整蛋白或消化后的多肽中引進(jìn)穩(wěn)定同位素（如2H、13C、15N、18O）標(biāo)記的小分子，用來(lái)識(shí)別不同樣品來(lái)源的肽段，經(jīng)“輕”質(zhì)和“重”質(zhì)同位素標(biāo)記的不同多肽互相作為內(nèi)標(biāo)，化學(xué)性質(zhì)基本上是一樣的，這樣就可以確保同一次質(zhì)譜掃描中兩者的離子化效果是相同的，此時(shí)肽質(zhì)譜峰信號(hào)成對(duì)出現(xiàn)，質(zhì)譜峰的信號(hào)強(qiáng)度就可以作為定量的依據(jù)。它們的相對(duì)強(qiáng)度就精確地反映了原樣品中多肽的比例（也就是蛋白的比例）。

細(xì)胞工程教研室一個(gè)肽的惟一適合的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)記有穩(wěn)定同位素的同細(xì)胞工程教研室

分類同位素標(biāo)簽引入方法生物代謝方式化學(xué)方式酶解過(guò)程引入同位素標(biāo)記引入法體內(nèi)標(biāo)記【代謝標(biāo)記法（SILAC）】體外標(biāo)記【化學(xué)標(biāo)記法（ICAT）】細(xì)胞工程教研室分類細(xì)胞工程教研室

生物代謝方式引入標(biāo)記原理

將一定量的相同種類但表達(dá)水平不同的兩個(gè)（細(xì)胞）樣品分別置于正常培養(yǎng)介質(zhì)和富含某重質(zhì)同位素（如：15N）的相同介質(zhì)中培養(yǎng)，一定時(shí)間后將兩者混合酶解，然后選擇性親和分離、色譜分離，并進(jìn)行質(zhì)譜分析。細(xì)胞工程教研室生物代謝方式引入標(biāo)記原理細(xì)胞工程教研室方法15N/14N蛋白質(zhì)標(biāo)記技術(shù)

分別用富含15N/14N的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)要比較的細(xì)胞或者簡(jiǎn)單生物體，通過(guò)生物代謝的方式以15N替代氨基酸組成中的14N，進(jìn)而把15N標(biāo)記引入蛋白質(zhì)組成中。由于氨基酸組成的不固定（從甘氨酸的1個(gè)到精氨酸的4個(gè)），因此還沒有把此標(biāo)記用在細(xì)胞培養(yǎng)上的報(bào)道。細(xì)胞工程教研室方法細(xì)胞工程教研室細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)簽技術(shù)（SILAC）

通過(guò)細(xì)胞的正常代謝，把穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸引入到蛋白質(zhì)組成中，大大簡(jiǎn)化質(zhì)譜定量分析前人工處理的復(fù)雜度。可用在細(xì)胞培養(yǎng)條件下的穩(wěn)定同位素有：2H、13C和15N等。細(xì)胞工程教研室細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)簽技術(shù)（SILAC）細(xì)胞工程教研室細(xì)胞工程教研室細(xì)胞工程教研室

酶解過(guò)程引入標(biāo)記18O/16O水

在兩個(gè)要比較的蛋白質(zhì)樣品的酶解過(guò)程中分別加入18O和16O水，這樣可特異性地對(duì)酶解肽段的C末端進(jìn)行標(biāo)記，等量混合后進(jìn)行質(zhì)譜分析樣品間蛋白質(zhì)組的差異?；旌蠘悠讽毧焖勹b定。酶解標(biāo)記H218O

在H218O的溶液中進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解，可在其C端穩(wěn)定結(jié)合1或2個(gè)18O原子。細(xì)胞工程教研室酶解過(guò)程引入標(biāo)記18O/16O水細(xì)胞工程教研室整體內(nèi)標(biāo)技術(shù)（GIST）通過(guò)用N-acetoxy-[2H3]-succinimide/N-acetoxy-succinimide(NAS)乙?；幚砻附怆亩?，把同位素標(biāo)簽引入樣本分析體系中。NAS可標(biāo)記必需氨基酸親和肽段的N末端。由于肽段的乙?；稽c(diǎn)不一，被標(biāo)記的重鏈和輕鏈質(zhì)量差也不固定，給自動(dòng)化分析帶來(lái)了一定困難。細(xì)胞工程教研室整體內(nèi)標(biāo)技術(shù)（GIST）細(xì)胞工程教研室親和標(biāo)簽法引入標(biāo)記原理

同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù)（ICAT）由Gygi等于1999年發(fā)明。此技術(shù)是利用同位素親和標(biāo)簽試劑，預(yù)先選擇性地標(biāo)記某一類蛋白質(zhì)，分離純化之后進(jìn)行MS鑒定。根據(jù)MS圖上不同同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽試劑標(biāo)記的一對(duì)肽段離子的強(qiáng)度比值定量分析樣品的相對(duì)豐度。細(xì)胞工程教研室親和標(biāo)簽法引入標(biāo)記原理細(xì)胞工程教研室ICAT試劑組成：反應(yīng)基團(tuán)（特異性結(jié)合肽鏈中半胱氨酸殘基的巰基）連接子（結(jié)合穩(wěn)定同位素）親和標(biāo)簽—生物素（可與卵白素結(jié)合，選擇性分離標(biāo)記的多肽）細(xì)胞工程教研室ICAT試劑組成：細(xì)胞工程教研室操作流程同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽輕試劑標(biāo)記的細(xì)胞蛋白質(zhì)1同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽重試劑標(biāo)記的細(xì)胞蛋白質(zhì)2混合，胰酶水解陽(yáng)離子交換卵白素親和層析LC分離，MS分析，數(shù)據(jù)庫(kù)檢索細(xì)胞工程教研室操作流程同位素標(biāo)記親和同位素標(biāo)記親和混合，陽(yáng)離細(xì)胞工程教研室優(yōu)點(diǎn)兼容任何生長(zhǎng)條件下的組織中的蛋白質(zhì)樣品；烷基化反應(yīng)高度特異；只分離含有半胱氨酸殘基的肽段，降低了體系的復(fù)雜性；可對(duì)膜蛋白進(jìn)行鑒定和定量；建立在色譜技術(shù)的基礎(chǔ)上，任何促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解的試劑都可使用；能直接鑒定和測(cè)量低豐度的蛋白質(zhì)。細(xì)胞工程教研室優(yōu)點(diǎn)細(xì)胞工程教研室缺點(diǎn)無(wú)法分析不含半胱氨酸的蛋白質(zhì)；同位素標(biāo)簽的存在影響肽段檢測(cè)和增加數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的復(fù)雜性；被標(biāo)記的含有兩個(gè)半胱氨酸的多肽質(zhì)量相差16u時(shí)與氧化作用很難區(qū)分；樣品成分復(fù)雜時(shí)，定量誤差會(huì)增大標(biāo)記效率具有時(shí)間依賴性，很難達(dá)到80%。細(xì)胞工程教研室缺點(diǎn)細(xì)胞工程教研室應(yīng)用測(cè)定和定量膜蛋白鑒定和定量低豐度蛋白質(zhì)細(xì)胞工程教研室應(yīng)用細(xì)胞工程教研室

ICAT技術(shù)改進(jìn)用13C/12C代替2H/1H，消除LC的同位素效應(yīng)固相同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽可剪切同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽（酸切割或光切割）可裂解同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽（cICAT）可視同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽（VICAT）細(xì)胞工程教研室ICAT技術(shù)改進(jìn)用13C/12C代替2H/1細(xì)胞工程教研室固相同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽其是將ICAT試劑與玻璃珠結(jié)合，使之固相化，通過(guò)固相捕捉和釋放等化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，LC／MS-MS分析蛋白質(zhì)的肽段。該方法與傳統(tǒng)的ICAT方法相比，更簡(jiǎn)單，更靈敏，更有效。而最大不同是固相ICAT試劑標(biāo)記蛋白質(zhì)是在酶解后進(jìn)行，而ICAT試劑標(biāo)記蛋白質(zhì)要求在酶解前。固相同位素標(biāo)簽試劑由4部分組成，氨丙基包被的玻璃珠、含有O-硝基苯的光裂解連接子、連接7個(gè)氫或7個(gè)氘的亮氨酸同位素標(biāo)簽和巰基特異反應(yīng)的碘乙酰胺基團(tuán)。細(xì)胞工程教研室固相同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽細(xì)胞工程教研室可裂解同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽用13C/12C代替了2H/1H使用了酸裂解連接子不同肽段質(zhì)量相差9u或9u的倍數(shù)親和標(biāo)簽試劑由3部分組成半胱氨酸特異性反應(yīng)基團(tuán)含9個(gè)同位素13C或12C標(biāo)簽的可裂解連接子親和純化生物素細(xì)胞工程教研室可裂解同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽細(xì)胞工程教研室可視同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽是在cICAT技術(shù)的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量的改進(jìn)方法。親和標(biāo)簽試劑由3種不同的同位素標(biāo)簽組成。用來(lái)標(biāo)記樣品的巰基標(biāo)記標(biāo)簽（VICAT）標(biāo)記內(nèi)標(biāo)多肽標(biāo)簽（14C-VICAT+6）等電聚焦標(biāo)記標(biāo)簽（14C-VICAT-28）細(xì)胞工程教研室可視同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽細(xì)胞工程教研室細(xì)胞工程教研室細(xì)胞工程教研室同位素標(biāo)記相對(duì)定量和絕對(duì)定量ICAT技術(shù)每次實(shí)驗(yàn)只能對(duì)兩個(gè)樣品進(jìn)行相對(duì)定量。新近出現(xiàn)的多重元素標(biāo)記的同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)（iTRAQ）在一定程度上解決了這一問題。它是2004年由ABI公司推出的一種可以同時(shí)對(duì)四組樣品進(jìn)行定量分析的方法，對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)比較多組樣品給予了有力的支持。細(xì)胞工程教研室同位素標(biāo)記相對(duì)定量和絕對(duì)定量細(xì)胞工程教研室iTRAQ試劑是非多聚體的等質(zhì)量標(biāo)記試劑，是由四種試劑組成的一組試劑，這四種試劑的分子量相同。每一種試劑都包括三部分：一個(gè)報(bào)告基團(tuán)（分子量分別為114u、115u、116u和117u）、一個(gè)平衡基團(tuán)（分子量分別為31u、

30u、29u和28u）和一個(gè)與肽段反應(yīng)的基團(tuán)。當(dāng)我們需要同時(shí)比較四組不同樣品時(shí)，樣品分別跟四種iTRAQ試劑結(jié)合，然后混合在一起做質(zhì)譜鑒定。細(xì)胞工程教研室iTRAQ試劑是非多聚體的等質(zhì)量標(biāo)記試劑，是由細(xì)胞工程教研室細(xì)胞工程教研室細(xì)胞工程教研室與ICAT試劑相比優(yōu)點(diǎn)是通量大。iTRAQ試劑對(duì)氨基的標(biāo)記是一種普遍標(biāo)記的模式，它的幾乎所有的肽段都能被標(biāo)記。但是，如果用這種普遍標(biāo)記的方法來(lái)大規(guī)模的鑒定和定量蛋白質(zhì)(理論上說(shuō)，每個(gè)蛋白質(zhì)只要有一條肽段就可以對(duì)其進(jìn)行鑒定和定量)，則是一件費(fèi)時(shí)費(fèi)力的事情。另外，在iTRAQ試劑標(biāo)記需要反應(yīng)體系的有機(jī)相體積高達(dá)60％以上，蛋白質(zhì)樣品很容易發(fā)生沉淀而損失，這也是該試劑的一個(gè)弱點(diǎn)。細(xì)胞工程教研室與ICAT試劑相比優(yōu)點(diǎn)是通量大。iTRAQ試劑細(xì)胞工程教研室四針對(duì)性親和標(biāo)簽技術(shù)

磷酸化蛋白質(zhì)同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽PHIAT技術(shù)是建立在ICAT技術(shù)基礎(chǔ)上的研究和鑒定磷酸化蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的新方法，且對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的鑒定有效。PHIAT試劑含有親核的巰基和同位素標(biāo)簽及其共價(jià)結(jié)合的生物素基團(tuán)。利用此方法已成功鑒定了酪蛋白和酵母提取物的磷酸化位點(diǎn)。細(xì)胞工程教研室四針對(duì)性親和標(biāo)簽技術(shù)磷酸化蛋白質(zhì)同位素標(biāo)記細(xì)胞工程教研室選擇性標(biāo)記特異性氨基酸同位素的化學(xué)探針標(biāo)記半胱氨酸標(biāo)記色氨酸標(biāo)記氨基酸N末端標(biāo)記羧基標(biāo)記細(xì)胞工程教研室選擇性標(biāo)記特異性氨基酸同位素的化學(xué)探針標(biāo)記細(xì)胞工程教研室非同位素的化學(xué)探針標(biāo)記（Label-freeLCMS/MS

）賴氨酸標(biāo)記

質(zhì)量豐度編碼標(biāo)簽（MCAT）是一種色譜標(biāo)記定量法。組氨酸標(biāo)記

利用了固相金屬親和色譜可富集含有組氨酸的肽段的特性。甲硫氨