微生物檢驗(yàn)方法

微生物檢驗(yàn)方法第五小組一、總則二、菌落總數(shù)三、糞大腸菌群四、霉菌和酵母菌一、總則1.范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品微生物學(xué)檢驗(yàn)的基本要求。本規(guī)范適用于化妝品樣品的采集、保存及供檢樣品制備。

2.儀器和設(shè)備天平高壓滅菌器振蕩器三角瓶(250mL)玻璃珠玻璃棒刻度吸管(1mL、10mL)研缽或均質(zhì)器恒溫水浴箱生理鹽水(成分：氯化鈉8.5g)蒸餾水加至1000mL,溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)，每瓶90mL，103.43kPa（121℃15lb）20min高壓滅菌。SCDLP液體培養(yǎng)基成分：酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄糖2.5g卵磷脂1g吐溫807g蒸餾水1000mL制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其它成分混合，加熱溶解，調(diào)pH為7.2～7.3分裝，103.43kPa（121℃15lb）20min高壓滅菌。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80充分混合，冷卻至25℃左右使用。注：如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。滅菌液體石蠟。滅菌吐溫80。3.培養(yǎng)基和試劑所采集的樣品，應(yīng)具有代表性。供檢驗(yàn)樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫檢驗(yàn)序號(hào)，并按檢驗(yàn)要求盡快檢驗(yàn)。若只有一個(gè)樣品而同時(shí)需做多種分析，如細(xì)菌、毒理、化學(xué)等，則宜先取出部分樣品做細(xì)菌檢驗(yàn)，再將剩余樣品做其它分析。在檢驗(yàn)過程中，從打開包裝到全部檢驗(yàn)操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴(kuò)散，所用器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無菌室內(nèi)進(jìn)行，或在相應(yīng)條件下，按無菌操作規(guī)定進(jìn)行。如檢出糞大腸菌群或其它致病菌，自報(bào)告發(fā)出之日起該菌種及被檢樣品應(yīng)保存一個(gè)月。4樣品的采集及注意事項(xiàng)液體樣品水溶性的液體樣品，可量取10mL加到90mL滅菌生理鹽水中，如樣品少于10mL，仍按10倍稀釋法進(jìn)行。如為5mL則加到45mL滅菌生理鹽水，混勻后，制成1：10檢液。油性液體樣品，取樣品10mL，先加5mL滅菌液體石蠟混勻，再加10mL滅菌的吐溫80，在40℃～44℃水浴中振蕩混合10min，加入滅菌的生理鹽水75mL（在40℃～44℃水浴中預(yù)溫），在40℃～44℃水浴中乳化，制成1：10的懸液。5供檢樣品的制備

膏、霜、乳劑半固體狀樣品

親水性的樣品：稱取10g，加到裝有玻璃珠及90mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩混勻，靜置15min。用其上清液作為1:10的檢液。疏水性樣品：稱取10g，放到滅菌的研缽中，加10mL滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加入10mL滅菌吐溫80，研磨待溶解后，加70mL滅菌生理鹽水，在40℃～44℃水浴中充分混合，制成1：10檢液。

固體樣品稱取10g，加到90mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1：10的檢液。如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等，可稱10g樣品加入90mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)1min～2min；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g樣品，加10mL滅菌液體石蠟，10mL吐溫80，70mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)3min～5min。二、菌落總數(shù)1范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法。本規(guī)范適用于化妝品菌落總數(shù)的測(cè)定。2定義菌落總數(shù)（Aerobicbacterialcount）是指化妝品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH值、需氧性質(zhì)等），1g（1mL）檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長(zhǎng)的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。測(cè)定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染的程度，是對(duì)樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)總評(píng)價(jià)的綜合依據(jù)。3儀器和設(shè)備

三角瓶，250mL。

量筒，200mL。pH計(jì)或精密pH試紙。高壓滅菌器。試管：15×150mm。滅菌平皿：直徑9cm。滅菌刻度吸管，10mL、1mL。酒精燈。恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。放大鏡。生理鹽水卵磷脂、吐溫80—營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g、牛肉膏3g、氯化鈉5g、瓊脂15g、卵磷脂1g、吐溫807g、蒸餾水1000mL制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80，將其他成分（除瓊脂外）加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80，混勻，調(diào)pH值為7.1～7.4，加入瓊脂，103.43kPa（121℃15lb）20min高壓滅菌，儲(chǔ)存于冷暗處備用。0.5％氯化三苯四氮唑成分：TTC0.5g蒸餾水100mL溶解后過濾，103.43kPa（121℃15lb）20min高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶，置4℃冰箱備用。4培養(yǎng)基和試劑(1)用滅菌吸管吸取1：10稀釋的檢液2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。另取1mL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中（注意勿使吸管接觸液面），更換一支吸管，并充分混勻，制成1：100檢液。吸取2mL，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1：10001:10000，……等，每種稀釋度應(yīng)換1支吸管。(2)將融化并冷至45℃～50℃的卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，每皿約15mL，隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h。另取一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，加入約15mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h，為空白對(duì)照。5操作步驟(3)為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在每100mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂中加入1mL0.5％的TTC溶液，如有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而化妝品的顆粒顏色無變化。6菌落計(jì)數(shù)方法先用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大5倍～10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一稀釋度各平皿生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長(zhǎng)時(shí)，該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘以2，以代表全皿菌落數(shù)。

(1)首先選取平均菌落數(shù)在30個(gè)～300個(gè)之間的平皿，作為菌落總數(shù)測(cè)定的范圍。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)（見表1中例1）。(4)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表1例5）。7菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法

(5)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30個(gè)～300個(gè)之間，其中一個(gè)稀釋度大于300個(gè)，而相鄰的另一稀釋度小于30個(gè)時(shí)，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表1中例6）。(3)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋

(2)若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30個(gè)～300個(gè)之間，則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來決定，若其比值小于或等于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，若大于2則報(bào)告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)（見表1中例2及例3）。(6)若所