微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇二.微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)路線三.提高內(nèi)生菌紫杉醇的產(chǎn)量的方法一、紫杉醇的概況和作用機制紅豆杉樹一、紫杉醇的概況和作用機制紫杉醇（Paclitaxel,商品名Taxol）的概述：1963年美國化學家瓦尼（M.C.Wani）和沃爾（MonreE.Wall）首次從一種生長在美國西部大森林中稱謂太平洋杉（PacificYew）樹皮和木材中分離到了紫杉醇的粗提物。1971年Wall和Wani將粗提物進行純化，并確定了其化學結(jié)構(gòu)（一種四環(huán)二萜化合物，并把它命名為紫杉醇（taxol））。2001年HuangQ等通過實驗獲得紫杉醇生物合成的重要中間產(chǎn)物紫杉二烯(Taxadiene,產(chǎn)量達13mg/L),成為基因工程菌合成紫杉醇中間體的先例。紫杉醇發(fā)現(xiàn)到臨床應(yīng)用大約經(jīng)歷了30年的時間。注：紫杉醇是一種復(fù)雜的具有抗癌活性的三環(huán)二萜類生物堿。紫杉醇的作用機制

它作用于細胞微管，通過與微管蛋白N端第31位氨基酸和217~231位氨基酸結(jié)合，誘導(dǎo)和穩(wěn)定微管蛋白聚合，抑制其解聚，增加聚合程度，使維管束不能與微管組織中心相互連接，將細胞周期阻斷于G2/M期，導(dǎo)致有絲分裂異?；蛲Ｖ?，阻止癌細胞增殖或腫瘤體積逐漸縮小。那么人們根據(jù)紫杉醇作用機制，研究出來紫杉醇能治療什么疾病呢？紫杉醇的臨床作用紫杉醇有抗腫瘤、抗癌作用。可治療卡波濟氏肉瘤(一種艾滋病人特有的惡性腫瘤)、直腸癌、膀胱癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌等一系列的棘手腫瘤；可治療卵巢癌、肺癌。紫杉醇具有抗類風濕性關(guān)節(jié)炎、抗瘧的作用,對中風、早老性癡呆和先天性多囊腎病、頭部和頸部腫瘤、惡性黑色素癌和肉瘤等,均展現(xiàn)出一定療效。紫杉醇還可誘導(dǎo)細胞凋亡,另外還有類似脂多糖(LPS)的作用,可調(diào)節(jié)機體的免疫功能。有人估計，治療一個卵巢癌患者需要6棵樹齡60~100年的紅豆杉樹。但紫杉醇已經(jīng)廣泛使用,并成為抗腫瘤的主流藥物之一。對紫杉醇的需求越大，對紅豆杉樹和環(huán)境都會造成嚴重的傷害。后來，人們發(fā)現(xiàn)了微生物發(fā)酵法二微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇的技術(shù)路線實驗材料羅漢松的樹皮實驗方法1內(nèi)生真菌分離2內(nèi)生真菌純化、鑒定與保存3發(fā)酵培養(yǎng)4發(fā)酵產(chǎn)物的處理（紫杉醇的提取、純化、含量測定）1內(nèi)生真菌分離1）對植物組織表面進行消毒,以控制表生真菌的生長,使內(nèi)生真菌得以分離。其分離方法是先用水沖洗已剪碎的植物材料,然后在75%乙醇中浸泡3min后,最后用無菌水沖洗。2）分離所用的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。為了防止細菌污染可在培養(yǎng)基中加抗菌素,如鏈霉素、四環(huán)素等。溫箱中28℃培養(yǎng)3-4d后觀察.在分離內(nèi)生真菌時常添加一些宿主植物的提取液，以滿足內(nèi)生真菌的一些特殊的營養(yǎng)需求

2內(nèi)生真菌純化、鑒定與保存

待培養(yǎng)基上初步長出菌落后，選擇長勢較好的菌落，挑取菌絲到PDA平板上純化，根據(jù)經(jīng)典形態(tài)學方法鑒定菌種。純化的菌株在PDA斜面4℃下保持，備用。3發(fā)酵培養(yǎng)從PDA平板上切取5mm×5mm小塊菌落,接種至裝有150mL液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,于28℃,100r/min搖床上振蕩培養(yǎng)10-14d.4發(fā)酵產(chǎn)物的處理

1）紫杉醇的提取常用的有機溶劑：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等提取原則：能夠充分萃取出發(fā)酵液和菌絲中的紫杉醇具體方法：發(fā)酵液過濾后,菌絲研磨（加適量石英砂），濾液稱量體積。濾渣烘干(低于50℃),濾渣用適量乙酸乙酯萃取,濾液用1/2濾液體積的乙酸乙酯萃取(30min),下層水層再用乙酸乙酯萃取一次,合并乙酸乙酯,減壓蒸餾。用適量甲醇洗滌減壓蒸餾得到的固體,再用正己烷