核酸提取常見試劑的作用原理

異硫氰酸胍強用力的蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級結(jié)構(gòu)的破壞消失而迅速與核酸分離。胍鹽是破壞蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的離液劑，在通常使用的蛋白質(zhì)變性劑中作用最強的是異硫氰酸胍，它們可以使多數(shù)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成一隨機的卷曲狀態(tài)。含有強力的陰離子和陽離子基團(tuán)，它們可以形成較強的氫鍵。在還原劑存在的情況下，異硫氰酸胍可以斷裂氫鍵，而去垢劑，如SDS存在的情況下，可以破壞疏水作用。鹽酸胍、尿素鹽酸胍是一個核酸酶的強抑制劑，它并不是一種足夠強的變性劑，可以允許完整的RNA從富含RNase的組織中提取出來。4-8M可斷裂氫鍵，有兩種可能機制：1變性蛋白和鹽酸胍、尿素優(yōu)先結(jié)合，形成變性蛋白-變性劑復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物被除去，從而引起N-D反應(yīng)平衡向右移動，隨著變性劑濃度增加，天然狀態(tài)的蛋白不斷轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)合物，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)完全變性；2鹽酸胍、尿素對氨基酸的增溶作用，能形成氫鍵，當(dāng)濃度高時，能破壞水的氫鍵結(jié)構(gòu)，結(jié)果鹽酸胍、尿素就稱為非極性殘基的較好溶劑，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水殘基伸展和溶解性加強，鹽酸胍、尿素引起的變性往往是不可逆的。高濃度尿素使蛋白質(zhì)變性并抑制Rnase活性十二烷基肌氨酸鈉使蛋白質(zhì)解體變性巰基試劑1防止蛋白質(zhì)或酶等（如輔酶A）分子中SH基團(tuán)氧化成二硫鍵，2在某些酶反應(yīng)過程中維持體系的還原環(huán)境。DTT，DDTE、巰基乙醇應(yīng)用最廣，谷胱甘肽也常應(yīng)用，由于他是生物體內(nèi)的還原劑，同時氧化后能被谷胱甘肽還原酶原位釋放。DNA提取中，常使用巰基乙醇，維持緩沖液的還原環(huán)境，防止多酚類氧化，由于具有一定的毒性，濃度不應(yīng)高于2%。巰基乙醇β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵（肽和蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸殘基中的鍵）。1還原蛋白質(zhì)二硫鍵，使Rna酶變性2抑制酚類氧化，若氧化，核酸會變成灰黑色，苯酚的氧化產(chǎn)物苯醌等氧化物引起磷酸二酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián)3保護(hù)蛋白質(zhì)的巰基蛋白質(zhì)提取中需要巰基乙醇還原二硫鍵，使RNA酶失活化學(xué)變性劑SDS、尿素、鹽酸胍能破壞疏水鍵、鹽鍵、氫鍵、范德華力使蛋白質(zhì)變性但不影響肽鍵和二硫鍵，不能使蛋白質(zhì)徹底變性加上還原劑巰基乙醇或DTT，能還原二硫鍵，使RNA徹底變性DTT二硫蘇糖醇刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇低很多。而且DTT比巰基乙醇的濃度低7倍時，兩者效果相近，但DTT價格略高一些。由于容易被空氣氧化，因此DTT的穩(wěn)定性較差；但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長它的使用壽命。由于質(zhì)子化的硫的親核性較低，隨著pH值的降低，DTT的有效還原性也隨之降低；DTT或含有DTT的溶液不能進(jìn)行高壓處理。抑制Rnase活性TCEP三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽半胱氨酸Trizol苯酚、異硫氰酸胍、8－羥基喹啉、β-巰基乙醇等。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯(lián)合使用可增強抑制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。液氮組織破碎，裂解細(xì)胞SDS十二烷基硫酸鈉陰離子去垢劑，高溫（55-65℃）裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，形成SDS/蛋白質(zhì)/多糖復(fù)合物，釋放核酸，提高鹽（KAc或NaAc）濃度并降低溫度（冰?。筍DS/蛋白質(zhì)/復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}酸形式，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀更加完全、離心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的DNA操作簡單，溫和，可提取到高分子量的DNA，但產(chǎn)物多糖類雜質(zhì)較多陽離子強表面活性劑，通常與蛋白酶K和抗氧化劑、螯合劑一起使用可破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離溶解膜類蛋白SDS能裂解細(xì)胞。使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和核酸之間常借著靜電引力或配位鍵結(jié)合，陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵，使染色體離析，蛋白變性，釋放核酸。（1）SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)的疏水部位;

（2）SDS可引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變

DNA裂解液的作用是破壞細(xì)胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，抑制細(xì)胞中Dnase的活性，而蛋白酶k的作用是將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來！溶菌酶溶壁酶DnaseRnase多糖水解酶：水解多糖飽和酚酚是一種有機溶劑,預(yù)先要用STE緩沖液飽和,因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發(fā)黃,而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)：故在制備酚飽和液時要加入82羥基喹嚀,以防止酚氧化。苯酚非極性分子水為極性分子使蛋白質(zhì)變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點：1.有效變性蛋白質(zhì)；2.抑制了DNase的降解作用。能有效使蛋白質(zhì)變性而出去，酚形成的有機相破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性，從而蛋白質(zhì)不會分布在水相中，避免核酸污染缺點：1.能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly（A）RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。酚變性大，但與水相有一定程度的互溶，大約10-15%的水溶在酚相中，使核酸損失酚（Phenol）對蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），應(yīng)此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。氯仿非極性分子水為極性分子去除脂肪,使更多蛋白質(zhì)變性,從而提高提取效率克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）氯仿變性不如酚好，但與水不混溶，不會帶走DNA因此混合使用最佳，經(jīng)酚第一次抽提的水相有殘留的酚，由于酚和氯仿互溶，可用氯仿第二次帶走酚，也可在第二次抽提中混合使用，比例為1：1苯酚/氯仿苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)非極性分子水為極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c他們混合時，蛋白質(zhì)分子見的水分子被擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性，經(jīng)離心，變性蛋白密度比對大，而與水相分離，苯酚/氯仿比重大，保留在最下層苯酚氯仿使蛋白質(zhì)變性量要足夠，因為苯酚去除蛋白是有一定的飽和度的，超過飽和度，裂解體系中蛋白質(zhì)不能被一次性去除，必須多次抽提。離心后分三層，下層有機層中有一些脂溶性的雜質(zhì)，中間層白色絮狀沉淀是蛋白，上清液中即含有核酸；變性后的蛋白質(zhì)從水相中析出，位于苯酚中或苯酚與水相之間。異戊醇抽提DNA，為混合均勻，容易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用，加入異戊醇降低分子表面張力，一般采用氯仿：異戊醇=24：1或酚：氯仿：異戊醇=25：24：1（不必先配置，臨用前加入即可）減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡。減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使DNA充分溶解于液相沉淀DNA時總會加入高濃度的鹽,加鹽的目的是破壞能使蛋白質(zhì)保持穩(wěn)定的兩個因素,使蛋白和DNA分離并沉淀下來.而此時鹽的陽離子會與DNA結(jié)合形成DNA-陽離子鹽溶于溶液中,再用無水乙醇可以將DNA-陽離子鹽沉淀下來提取DNA時先加0.14mol/L氯化鈉，因為在這種濃度的氯化鈉溶液中，DNA的溶解度最低，而蛋白質(zhì)的溶解度增加，這樣通過過濾能將DNA分離開，以除去蛋白質(zhì)。再加入95%的酒精能使DNA沉淀，因為在這個濃度下DNA溶解度最低。如果直接加酒精不先加氯化鈉，DNA和蛋白質(zhì)都能被酒精所沉淀，就無法將DNA和蛋白質(zhì)分離開。所以必須先加氯化鈉后加酒精，順序不能顛倒。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。這樣可以是DNA沉淀出來在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。檸檬酸鈉它可以控制反應(yīng)體系的離子強度，同時還有一定的緩沖作用，保證體系PH的相對穩(wěn)定狀態(tài)，總之檸檬酸鈉在這里的作用類似于食物中的防腐劑。DEPC焦碳酸二乙酯，它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。與肝素何用效果增強。在Tris中不穩(wěn)定，很快會分解為二氧化碳和乙醇。強烈但不徹底的RNA酶抑制劑0.1%濃度Tris-HCl緩沖體系，使pH變化不會太大異丙醇加入異丙醇之后立即出現(xiàn)絮狀沉淀，我一直以為這是正確的，看了帖子才知道是蛋白質(zhì)污染，異丙醇的沉淀效果要比無水乙醇的沉淀效果要好，但是異丙醇沉淀有一個弊端就是會沉淀下來好多的鹽和蛋白質(zhì)這樣會影響下一步的操作，一般我加異丙醇是等體積的效果還可以。70%乙醇70%乙醇洗滌DNA沉淀(因為在70%乙醇里DNA是不溶的,而鹽離子卻可溶),用無水乙醇則達(dá)不到這個目的!乙醇對于蛋白質(zhì)、核酸的沉淀效應(yīng)隨分子量加大而增大，小分子的核酸和蛋白質(zhì)碎片是可以溶于75%乙醇的。漂洗DNA，是為了去除殘余的鹽類，去除過量SDS和酚等雜物，因為SDS在70%的乙醇中保持溶解狀態(tài)，不與DNA共沉淀，從而通過棄上清液去除這種去污劑,避免對以后PCR反應(yīng)的影響。DEPC（焦碳酸二乙酯）:常用RNA酶抑制劑，與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性,強烈但不徹底的RNA酶抑制劑甲酰胺用高濃度甲酰胺替代苯酚從細(xì)胞裂解物的蛋白酶K消化物中分離抽提DNA，甲酰胺是一種離子化溶劑，能分離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物并使蛋白變性和釋放，因其不影響蛋白酶K的活性，特別適于分離高分子質(zhì)量的DNA，其分離物籍火棉膠袋的透析，去除變性蛋白進(jìn)而純化DNA。聚乙二醇PEG有機聚合物，無毒，親水性強，相對分子量6-20k，沉淀效果主要與其本身的濃度和分子量有關(guān)，同時受離子強度、溶液pH值和溫度等因素的影響，采用該方法可將病毒濃縮10倍以上。為一種非離子多聚物，多離子多聚物是六十年代發(fā)展起來的一類重要沉淀劑?；诙嗑畚锏某恋碜饔弥饕蕾囉诙嗑畚锏臐舛群捅怀恋砦锏姆肿恿看笮?，Laurent等(1967)提出PEG的沉淀機理主要是通過空間位置排斥，使液體中的微粒(包括生物大分子、病毒和細(xì)菌等)被迫集聚在—起而引起沉淀的發(fā)生。PEG最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白(IgG)和沉淀一些細(xì)菌病毒，今年來逐漸應(yīng)用于核酸和酶的分離純化，特別是用PEG分離質(zhì)粒DNA，已相當(dāng)普遍。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA，可以在500ulDNA液中加入200ul20％PEG8000(含1．2mol／LNaCl)，冰浴20min(Lieta1．，1994)。該操作的優(yōu)點在于：操作條件溫和，不易引起生物大分子的