分子生物學(xué)課件：第四章 PCR技術(shù)與DNA測(cè)序

第四講PCR技術(shù)與DNA測(cè)序背景知識(shí)分子生物學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)科學(xué)，非常注重實(shí)驗(yàn)操作的學(xué)科，在其發(fā)展歷史上，幾乎每一次重大理論的發(fā)現(xiàn)與突破都離不開新技術(shù)、新方法的支撐。分子生物學(xué)技術(shù)也是在分子水平上開展生物醫(yī)學(xué)研究的共同工具，一些技術(shù)還廣泛用于臨床疾病的診斷與治療等。掌握和了解一些常用的分子生物學(xué)技術(shù)，不僅有助于進(jìn)一步加深理解分子生物學(xué)的理論知識(shí)，而且對(duì)于在分子水平上深入認(rèn)識(shí)疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制、理解和應(yīng)用基于分子生物學(xué)的診斷和治療方法極有幫助。分子生物學(xué)技術(shù)的種類非常繁多，但按照其復(fù)雜性程度不同則可將其大致區(qū)分為基本技術(shù)和延伸拓展類技術(shù)兩大類：

1.基本技術(shù)：包括核酸的分離純化、PCR技術(shù)、分子雜交與印跡技術(shù)、各種分子酶學(xué)操作等。

2.延伸拓展類技術(shù)：包括DNA重組技術(shù)、測(cè)序技術(shù)、生物芯片、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、RNA干擾技術(shù)等，此類技術(shù)從本質(zhì)上來講一般都是在前述基本技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的。

PartI

PCR技術(shù)P402聚合酶鏈（式）反應(yīng)（Polymerasechainreaction,PCR）知識(shí)體系PCR技術(shù)簡(jiǎn)史原理反應(yīng)體系技術(shù)特點(diǎn)結(jié)果檢測(cè)衍生技術(shù)一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)史PCR技術(shù)，是上個(gè)世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種在體外對(duì)特定的DNA片段進(jìn)行高效擴(kuò)增的技術(shù)。應(yīng)用這一技術(shù)可以將特定的微量靶DNA片斷于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍。PCR技術(shù)的創(chuàng)立對(duì)于分子生物學(xué)的發(fā)展具有不可估量的價(jià)值，它以敏感度高、特異性強(qiáng)、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)迅速成為分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的方法，極大的推動(dòng)了分子生物學(xué)本身以及整個(gè)生物醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展。PCR技術(shù)當(dāng)之無愧是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性技術(shù)創(chuàng)舉和里程碑。PCR的實(shí)現(xiàn)

1985年,Mullis等

PCR技術(shù)是于1985年由時(shí)任美國(guó)PE-Cetus公司的技術(shù)人員KaryMullis建立。但事實(shí)上，早在1971年，KjellKleppe等描述的一項(xiàng)基于酶的體外DNA復(fù)制實(shí)驗(yàn)，實(shí)際上已經(jīng)觸及PCR技術(shù)原理的本質(zhì)。但遺憾的是，這在當(dāng)時(shí)并沒有引起人們足夠的重視，而這也恰好成為日后PCR專利之爭(zhēng)的一個(gè)起因。

PCR的實(shí)現(xiàn)

1985年,Mullis等

1985年，Cetus公司的日裔人員RandallSaiki等在Science雜志首次發(fā)表了將PCR用于鐮刀狀貧血基因診斷的論文。1987年7月，PCR技術(shù)在美國(guó)獲得了專利批準(zhǔn)，為Cetus公司所有。同年，Cetus公司和Perkin-Elmer公司合資開發(fā)生產(chǎn)用于PCR的DNA熱循環(huán)儀。藥業(yè)巨頭瑞士Roche公司于1992年以三億三千五百萬美元的天價(jià)購(gòu)買了Cetus公司的PCR專利。PCR的實(shí)現(xiàn)

1985年,Mullis等

由于Mullis最初使用的DNA聚合酶在高溫下失活，需要每輪反應(yīng)添加新鮮的DNA聚合酶，花費(fèi)巨大而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。后來Cetus公司根據(jù)臺(tái)灣學(xué)者錢嘉韻的研究成果，成功分離出耐高溫的TaqDNA聚合酶，并將其成功用于PCR。此酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用成為PCR技術(shù)自動(dòng)化的關(guān)鍵性“臨門一腳”，使得PCR技術(shù)迅速得以廣泛推廣。PCR的實(shí)現(xiàn)

1985年,Mullis等

1993年，Mullis因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，正如TimAppenzella在評(píng)論中所述：PCR確實(shí)僅僅是實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)小技巧（trick），與以往的諾貝爾獎(jiǎng)研究項(xiàng)目相比，其中的知識(shí)和智慧含量似乎并不豐富；但是無論如何，PCR對(duì)于分子生物學(xué)的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其它所有的技術(shù)。提高效率的思路雙鏈單鏈循環(huán)DNA聚合酶儀器改進(jìn)高溫低溫PCR的改進(jìn)與完善

大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段

T4DNA聚合酶

TaqDNA多聚酶

二、PCR技術(shù)的基本原理PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制過程，即以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板、以一對(duì)分別與模板5'-末端和3'-末端相互補(bǔ)的寡核苷酸片斷為引物、以四種dNTP為原料、由DNA聚合酶按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸而合成新的DNA，不斷重復(fù)這一過程，即可使目的DNA分子得到擴(kuò)增。AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母鏈DNA

復(fù)制過程中形成的復(fù)制叉子代DNA

參與DNA復(fù)制的物質(zhì)底物(substrate):

dNTP——加入聚合酶(polymerase):DNA聚合酶——分離模板(template):DNA母鏈——提取引物(primer):——人工合成其他的酶和蛋白質(zhì)因子——Mg2+,PCR儀圖：PCR反應(yīng)過程PCR反應(yīng)的基本原理示意圖3’

TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG…GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT5’5’ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATCCTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA3’

變性（950C，30s）3’TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCTATCCAACGGCTAGGCATTT5’5’ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC…CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA3’退火（450C～550C，30s～1min）5’ataagcccgaaaggt3’3’aacggctaggcattt5’TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCTATCCAACGGCTAGGCATTTATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATCCTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA5’ataagcccgaaaggttcgtccaacggctaggcattt5’延伸（720C，1～幾分鐘）TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCTATCCAACGGCTAGGCATTTataagcccgaaaggttcgttGATCCTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAAATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATCCTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCtatccaacggctaggcattt循環(huán)25～305′3′5′3′目的DNA擴(kuò)增106-7倍

類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：1.基本原理②退火（annealing）（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，將溫度降至引物的Tm值左右或以下（55℃左右），引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合，形成雜交鏈。①變性（denature）：模板DNA經(jīng)加熱至95℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。③延伸(extension)：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

以上三步為一個(gè)循環(huán)，約需2～4分鐘，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板，如此循環(huán)30次，大約2～3小時(shí)后，新生DNA片段理論上可達(dá)到2n-1個(gè)分子拷貝。5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

5

5

5

5

TemplateDNA5

5

5

5

5

5

5

5

目的片段？？？Cycle35

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。1.標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系（50～100ul）

三、PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件10×緩沖液

buffer

1/10體積

4種dNTP混合物各200μmol/L

引物Primer1,2(上,下游)各1μmol/L

模板DNA

102

～105

拷貝TaqDNA聚合酶1～5μ

l

Mg2+

1.5mmol/L

雙蒸水ddH2O至50～100

μ

l2.PCR引物設(shè)計(jì)兩條引物，即5′端引物和3′引物。以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)）TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAGGATCTATCCAACGGCTAGGCATTTATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATCCTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA5’ataagcccgaaaggttcgtccaacggctaggcattt5’5′3′5′3′基準(zhǔn)（編碼鏈）①引物長(zhǎng)度：15-30bp，常為20bp左右。②引物堿基：ATGC最好隨機(jī)分布。③引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。④兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物設(shè)計(jì)的基本原則：⑤引物與非擴(kuò)增區(qū)序列不要超過70%相同。⑥引物3′端的堿基應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，最佳選擇是G和C。⑦引物的5′端可以修飾。幾種常見引物設(shè)計(jì)缺陷引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0（自動(dòng)搜索）*Oligo6（引物評(píng)價(jià)）VectorNTISuitDNAsisOmigaDNAstarPrimer3（在線服務(wù)）3.模板的制備PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)。四、PCR反應(yīng)特點(diǎn)

決定因素為：①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；（關(guān)鍵）②堿基配對(duì)原則；③TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；④靶基因的特異性與保守性。1.特異性強(qiáng)3.簡(jiǎn)便、快速

4.對(duì)標(biāo)本的純度要求低2.靈敏度高五、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析

1.凝膠電泳分析瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳紫外線/燈下觀察結(jié)果594bp600bp2652bp800bp50bp350bpM123HCMVPCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果PCR擴(kuò)增結(jié)果2.酶切分析

3.分子雜交

4.核酸序列分析

酶切結(jié)果酶切結(jié)果六、常用的PCR衍生技術(shù)1.逆轉(zhuǎn)錄PCR

（reversetranscriptionPCR,RT-PCR）（1）概念：是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)，也稱反轉(zhuǎn)錄

PCR。模板———RNA原料———dNTP引物逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)物———互補(bǔ)的DNA鏈實(shí)質(zhì)———復(fù)制（2）參與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的要素2.逆轉(zhuǎn)錄酶多功能酶：①RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；②RNA酶H（RNaseH）活性，能特異性水解RNA-DNA雜交體上的RNA；③具有DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性④沒有3′5′外切酶活性☆細(xì)胞總RNA的檢測(cè)

1.TotalRNAextractedfrom293transfectedwithpAd-CMV-E6/E72.TotalRNAextractedfrom293transfectedwithpAd-K14-E6/E7

3.RT-PCR的反應(yīng)體系MgCl24μl（5mmol/L）Buffer2μl（1×）dNTP混合物8μl（1μmol/L）RNase抑制劑0.5μl（1u/μl）反轉(zhuǎn)錄酶1μl（0.25u/μl）引物1μl（2.5μmol/L）總RNA1μl（1μg）無RNase的dH2O至總體積20μl逆轉(zhuǎn)錄體系逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在420C進(jìn)行1h后，加熱至950C5min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。取2μl反應(yīng)產(chǎn)物，按DNA為模板的PCR反應(yīng)步驟，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。☆

HPV-16E6/E7在轉(zhuǎn)錄水平的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

1.Marker：100bpDNAMarker;2.RT-PCR產(chǎn)物：E6/E7基因;3.陰性對(duì)照

RT-PCR鑒定pAd-CMV-E6/E7轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中E6/E7的表達(dá)

2.巢式PCR先用一對(duì)外側(cè)引物擴(kuò)增含目的基因的大片段，再用內(nèi)側(cè)引物以大片段為模板擴(kuò)增獲取目的基因。筑巢PCR可以提高PCR的效率和特異性。適于模板含量較低的樣本。目的片段第一輪PCR第二輪PCRCG二核苷酸是最主要的甲基化位點(diǎn)。C-CH3G——C-CH3G

引物1：GCCG——UG

TG

引物2：

AC3.甲基化特異性PCR——檢測(cè)甲基化4.多重PCR—多個(gè)PCR同時(shí)進(jìn)行在一次反應(yīng)中加入多對(duì)引物，由于每一對(duì)引物與模板DNA的不同片段相結(jié)合，因而擴(kuò)增片段長(zhǎng)短不同。由此可檢測(cè)是否存在某些基因片段的缺失或突變。片段1片段25.原位PCR—PCR技術(shù)與原位雜交結(jié)合在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。在組織細(xì)胞原位檢測(cè)單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列。①固定組織或細(xì)胞②蛋白酶K消化處理③PCR擴(kuò)增：原位PCR儀④雜交⑤顯微鏡觀察結(jié)果原位PCR儀——玻片常規(guī)PCR儀——擴(kuò)增管6.定量PCR廣義概念的定量PCR技術(shù)是指以外參或內(nèi)參為標(biāo)準(zhǔn)，通過對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析或PCR過程的監(jiān)測(cè)，進(jìn)行PCR起始模板量的定量。狹義概念的定量PCR技術(shù)（嚴(yán)格意義的定量PCR技術(shù)）是指用外標(biāo)法（熒光雜交探針保證特異性）通過監(jiān)測(cè)PCR過程（監(jiān)測(cè)擴(kuò)增效率）達(dá)到精確定量起始模板數(shù)的目的，同時(shí)以內(nèi)對(duì)照有效排除假陰性結(jié)果(擴(kuò)增效率為零)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（real-timePCR），是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)發(fā)光可分為兩種：

①熒光探針

②熒光染料

①

TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收。②SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。擴(kuò)增曲線：4個(gè)階段②Ct值（循環(huán)閾值，Cyclethreshold）：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)熒光域值（threshold）：PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：熒光信號(hào)開始由本底信號(hào)進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度。熒光閾值循環(huán)次數(shù)③Ct值與起始模板的關(guān)系每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。七、PCR技術(shù)的應(yīng)用目的DNA的獲得核酸定量分析臨床醫(yī)學(xué)：遺傳病、病原體、基因診斷法醫(yī)學(xué)動(dòng)植物檢疫食品安全：轉(zhuǎn)基因檢測(cè)PartIIDNA測(cè)序技術(shù)（DNAsequencing，DNA序列測(cè)定）P415

DNA的測(cè)序是分子生物學(xué)研究中非常重要和關(guān)鍵的內(nèi)容。DNA序列測(cè)定方法：1.Sanger的雙脫氧法：A/T/G/C四個(gè)反應(yīng)。2.化學(xué)降解法：G反應(yīng)；G+T反應(yīng)；T+C反應(yīng)和C反應(yīng)。3.自動(dòng)測(cè)序法。DNA測(cè)序的主要方法有兩種，即雙脫氧鏈終止法（Sanger法、酶促法）和化學(xué)裂解法（Maxam-Gelbert法）。二者均依賴于高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。一、Sanger雙脫氧鏈終止法（一）原理(單鏈)DNA鏈中的核苷酸是以3`，5`-磷酸二酯鍵相連接，合成DNA所用的底物是2`-脫氧核苷三磷酸（dNTP），在Sanger雙脫氧鏈終止法中被摻入了2`，3`-雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP),當(dāng)ddNTP位于鏈延伸末端時(shí),由于它沒有3`-OH，不能再與其它的脫氧核苷酸形成3′,

5′-磷酸二酯鍵，DNA合成便在此處終止，如果此處摻入的是一個(gè)ddATP，則新生鏈的末端就是A，依次類推可以通過摻入ddTTP、ddCTP、ddGTP，則新生鏈的末端為T、C或G。Sanger1977年雙脫氧核苷三磷酸互補(bǔ)鏈合成過程233基于DNA聚合酶的催化特性：①以DNA為模板，形成正確的模板DNA互補(bǔ)鏈；②能以dNTP作為底物，也能利用ddNTP作底物。

在4組獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入4種不同的ddNTP，結(jié)果將生成4組核苷酸鏈，它們將分別（隨機(jī)）終止于每一個(gè)A，每一個(gè)G，每一個(gè)C，每一個(gè)T的位置上。對(duì)這4組核苷酸鏈進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。Sanger雙脫氧測(cè)序方法示意圖+G+ddGGATTCGGATTCddGGATTCGAGGATTCGAddGGGG引物電泳雙脫氧法測(cè)序原理示意圖①設(shè)置4個(gè)反應(yīng)②各反應(yīng)加入待測(cè)DNA、引物、DNA聚合酶I（失去5′3′外切核酸酶活性）、dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）③每管分別加入1種ddNTP

（如ddTTP、dTTP）。ddTTP的比例很?。?:10）④摻入的位點(diǎn)是隨機(jī)的⑤引物末端用放射性核素標(biāo)記歸納如下：二、Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法基本原理：用化學(xué)試劑處理具有末端放射性標(biāo)記的DNA片段，造成堿基的特異性切割，由此產(chǎn)生一組具有各種不同長(zhǎng)度的DNA鏈的反應(yīng)混和物，經(jīng)凝膠電泳按大小分離和放射自顯影，便可根據(jù)X線片底板上顯示相應(yīng)帶譜，直接讀出待測(cè)DNA片段的核苷酸順序。

化學(xué)修飾法的待測(cè)DNA片段有的是雙鏈，有的是單鏈DNA。在進(jìn)行堿基特異性化學(xué)切割反應(yīng)前，首先對(duì)待測(cè)DNA片段作末端標(biāo)記，使其末端(5′端或者是3′端)帶上放射標(biāo)記。如果待測(cè)DNA是雙鏈，必須使其形成末端標(biāo)記的單鏈。對(duì)末端標(biāo)記的DNA鏈進(jìn)行化學(xué)斷裂反應(yīng)分兩步進(jìn)行：第一步是在4個(gè)反應(yīng)管中分別以肼、硫酸二甲酯(DMS)和甲酸對(duì)特定的堿基進(jìn)行化學(xué)修飾；第二步是以六氫吡啶取代被修飾的堿基并將DNA鏈斷裂。DNA化學(xué)裂解反應(yīng)體系反應(yīng)體系堿基修飾試劑堿基修飾反應(yīng)主鏈斷裂試劑斷裂點(diǎn)G硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化六氫吡啶

GG+A