RFLP限制性片段長度多態(tài)性

限制性片段長度多態(tài)性RFLP匯報人:郭建強限制性片段長度多態(tài)性RFLP

1RFLP技術的簡介

2RFLP中應用的限制性內切酶

3RFLP的實驗步驟

4RFLP技術的應用

分子標記的歷史第一代分子標記技術RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性片段長度多態(tài)性）第二代分子標記技術

RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，隨機擴增多態(tài)性DNA）AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，擴增片斷長度多態(tài)性）事實上，還有很多分子標記技術像SSR、ISSR、SRAP（相關序列擴增多態(tài)性）另外，還有現在號稱為第三代分子標記的SNP（單核苷酸多態(tài)性)RPLF技術的簡介個體差異差異大多數都是由于不編碼蛋白質的區(qū)域和沒有重要調節(jié)功能的區(qū)域發(fā)生中立突變。這些突變構成的差異成為DNA多態(tài)性。假如DNA順序中的某個堿基發(fā)生了突變，使突變所在部位的DNA序列產生（或缺失）某種限制性內切酶的位點。這樣，利用該限制性內切酶消化此DNA時，便會產生與正常不同的限制性片段。在同種生物的不同個體中會出現不同長度的限制性片段類型，即限制性片段多態(tài)性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）。

RFLP作為一種“遺傳路標”，對人類基因組制圖提供必要的標記，當多態(tài)性順序與人類遺傳性疾病位點連鎖時，可作為遺傳缺陷的產前診斷或是鑒別攜帶者的標記，還可以應用于親子鑒定和群體研究等方面。RPLF技術的原理利用特定的限制性內切酶識別并切割不同生物個體的基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，所產生的DNA數目和各個片段的長度反映了DNA分子上不同酶切位點的分布情況。通過凝膠電泳分析這些片段，就形成不同帶，然后與克隆DNA探針進行Southern雜交和放射顯影，即獲得反映個體特異性的RFLP圖譜。它所代表的是基因組DNA在限制性內切酶消化后產生片段在長度上差異。由于不同個體的等位基因之間堿基的替換、重排、缺失等變化導致限制內切酶識別和酶切發(fā)生改變從而造成基因型間限制性片段長度的差異。

RFLP的類型1.點的多態(tài)性表現為DNA鏈中發(fā)生單個堿基的突變，且突變導致一個原有酶切位點的丟失或形成一個新的酶切位點。Southern雜交即可診斷。2.序列多態(tài)性①由于DNA順序上發(fā)生突變如缺失、重復、插入所致。②由于高變區(qū)（highlyvariableregion）內串聯(lián)重復順序的拷貝數不同所產生的，其突出特征是限制性內切酶識別位點本身的堿基沒有發(fā)生改變，改變的只是它在基因組中的相對位置。

RFLP中應用的限制性內切酶限制性內切酶（restrictionendonuclease）是一類具有特殊功能的核酸切割酶，不同的內切酶可辨認并作用于特異的DNA序列，并將DNA切斷。常用的限制性內切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子記則有幾個甚至上千個。分子記越多，則所構建的圖譜就越飽和。構建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標之一。

三種限制性內切酶如酶的識別位點上兩條DNA鏈均未甲基化，就行使內切酶功能，但切割點不在識別位點，而在1kb（不少于400bp）或nkb(最多7kb)處隨機切割.I型酶II型酶III型酶就是通常指的DNA限制性內切酶，II型限制酶分子量小、僅需Mg2＋作為催化反應輔助因子。它們能識別雙鏈DNA的特異順序，并在這個順序內進行切割，產生特異的DNA片段。與I型酶特性類似，也有甲基化功能。不同的是它能在DNA鏈上的特異位點切割，其切割位點在識別位點以外，對基因工程的意義也不大RFLP技術的步驟Southern雜交轉膜凝膠電泳分開DNA片段酶切不同個體DNA的提取數據分析PCR擴增目的片斷抽提DNA或PCR擴增后的DNA經內切酶酶切,然后在瓊脂糖凝膠電泳分析，適合較小分子的DNA分析DNA先酶切，電泳分離，變性后轉移到尼龍膜或硝酸纖維膜，然后與同位素標記的探針雜交，最后做放射自顯形，就可檢測出多態(tài)性條帶。不同個體DNA的提取1.采用適當的化學試劑裂解細胞，或者用組織勻漿器研磨破碎組織中的細胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質和RNA；3.用有機試劑（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白質。酶切一般選擇一種限制酶來切割DNA分子，但有時為了某些特殊的目的，分別用不同的限制酶消化基因組DNA。切割DNA的條件可根據不同目的設定，有時可采用部分和充分消化相結合的方法獲得一些具有交叉順序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65℃加熱滅活限制酶,樣品即可直接進行電泳分離，必要時可進行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品后再進行電泳分離。

凝膠電泳分開DNA片段在恒定電壓下，將DNA樣品放在0.8～1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，標準的瓊脂糖凝膠電泳可分辨70－80000bp的DNA片段，故可對DNA片段進行分離