RFLP限制性片段長度多態(tài)性

限制性片段長度多態(tài)性RFLP匯報(bào)人:郭建強(qiáng)限制性片段長度多態(tài)性RFLP

1RFLP技術(shù)的簡介

2RFLP中應(yīng)用的限制性內(nèi)切酶

3RFLP的實(shí)驗(yàn)步驟

4RFLP技術(shù)的應(yīng)用

分子標(biāo)記的歷史第一代分子標(biāo)記技術(shù)RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性片段長度多態(tài)性）第二代分子標(biāo)記技術(shù)

RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性）事實(shí)上，還有很多分子標(biāo)記技術(shù)像SSR、ISSR、SRAP（相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性）另外，還有現(xiàn)在號稱為第三代分子標(biāo)記的SNP（單核苷酸多態(tài)性)RPLF技術(shù)的簡介個(gè)體差異差異大多數(shù)都是由于不編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域和沒有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域發(fā)生中立突變。這些突變構(gòu)成的差異成為DNA多態(tài)性。假如DNA順序中的某個(gè)堿基發(fā)生了突變，使突變所在部位的DNA序列產(chǎn)生（或缺失）某種限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)。這樣，利用該限制性內(nèi)切酶消化此DNA時(shí)，便會(huì)產(chǎn)生與正常不同的限制性片段。在同種生物的不同個(gè)體中會(huì)出現(xiàn)不同長度的限制性片段類型，即限制性片段多態(tài)性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）。

RFLP作為一種“遺傳路標(biāo)”，對人類基因組制圖提供必要的標(biāo)記，當(dāng)多態(tài)性順序與人類遺傳性疾病位點(diǎn)連鎖時(shí)，可作為遺傳缺陷的產(chǎn)前診斷或是鑒別攜帶者的標(biāo)記，還可以應(yīng)用于親子鑒定和群體研究等方面。RPLF技術(shù)的原理利用特定的限制性內(nèi)切酶識別并切割不同生物個(gè)體的基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，所產(chǎn)生的DNA數(shù)目和各個(gè)片段的長度反映了DNA分子上不同酶切位點(diǎn)的分布情況。通過凝膠電泳分析這些片段，就形成不同帶，然后與克隆DNA探針進(jìn)行Southern雜交和放射顯影，即獲得反映個(gè)體特異性的RFLP圖譜。它所代表的是基因組DNA在限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生片段在長度上差異。由于不同個(gè)體的等位基因之間堿基的替換、重排、缺失等變化導(dǎo)致限制內(nèi)切酶識別和酶切發(fā)生改變從而造成基因型間限制性片段長度的差異。

RFLP的類型1.點(diǎn)的多態(tài)性表現(xiàn)為DNA鏈中發(fā)生單個(gè)堿基的突變，且突變導(dǎo)致一個(gè)原有酶切位點(diǎn)的丟失或形成一個(gè)新的酶切位點(diǎn)。Southern雜交即可診斷。2.序列多態(tài)性①由于DNA順序上發(fā)生突變?nèi)缛笔?、重?fù)、插入所致。②由于高變區(qū)（highlyvariableregion）內(nèi)串聯(lián)重復(fù)順序的拷貝數(shù)不同所產(chǎn)生的，其突出特征是限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)本身的堿基沒有發(fā)生改變，改變的只是它在基因組中的相對位置。

RFLP中應(yīng)用的限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）是一類具有特殊功能的核酸切割酶，不同的內(nèi)切酶可辨認(rèn)并作用于特異的DNA序列，并將DNA切斷。常用的限制性內(nèi)切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子記則有幾個(gè)甚至上千個(gè)。分子記越多，則所構(gòu)建的圖譜就越飽和。構(gòu)建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標(biāo)之一。

三種限制性內(nèi)切酶如酶的識別位點(diǎn)上兩條DNA鏈均未甲基化，就行使內(nèi)切酶功能，但切割點(diǎn)不在識別位點(diǎn)，而在1kb（不少于400bp）或nkb(最多7kb)處隨機(jī)切割.I型酶II型酶III型酶就是通常指的DNA限制性內(nèi)切酶，II型限制酶分子量小、僅需Mg2＋作為催化反應(yīng)輔助因子。它們能識別雙鏈DNA的特異順序，并在這個(gè)順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的DNA片段。與I型酶特性類似，也有甲基化功能。不同的是它能在DNA鏈上的特異位點(diǎn)切割，其切割位點(diǎn)在識別位點(diǎn)以外，對基因工程的意義也不大RFLP技術(shù)的步驟Southern雜交轉(zhuǎn)膜凝膠電泳分開DNA片段酶切不同個(gè)體DNA的提取數(shù)據(jù)分析PCR擴(kuò)增目的片斷抽提DNA或PCR擴(kuò)增后的DNA經(jīng)內(nèi)切酶酶切,然后在瓊脂糖凝膠電泳分析，適合較小分子的DNA分析DNA先酶切，電泳分離，變性后轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維膜，然后與同位素標(biāo)記的探針雜交，最后做放射自顯形，就可檢測出多態(tài)性條帶。不同個(gè)體DNA的提取1.采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑裂解細(xì)胞，或者用組織勻漿器研磨破碎組織中的細(xì)胞；2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白質(zhì)和RNA；3.用有機(jī)試劑（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白質(zhì)。酶切一般選擇一種限制酶來切割DNA分子，但有時(shí)為了某些特殊的目的，分別用不同的限制酶消化基因組DNA。切割DNA的條件可根據(jù)不同目的設(shè)定，有時(shí)可采用部分和充分消化相結(jié)合的方法獲得一些具有交叉順序的DNA片段。消化DNA后，加入EDTA，65℃加熱滅活限制酶,樣品即可直接進(jìn)行電泳分離，必要時(shí)可進(jìn)行乙醇沉淀，濃縮DNA樣品后再進(jìn)行電泳分離。

凝膠電泳分開DNA片段在恒定電壓下，將DNA樣品放在0.8～1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳可分辨70－80000bp的DNA片段，故可對DNA片段進(jìn)行分離