動植物細胞培養(yǎng)技術

2.3動物細胞培養(yǎng)技術1962年，實現(xiàn)了倉鼠腎細胞（BHK）的大規(guī)模培養(yǎng)，這一成果標志著動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術的成熟與商業(yè)應用時代的開始。1975年，成功融合了小鼠B淋巴細胞和骨髓瘤細胞，構建了能生產(chǎn)特定單克隆抗體的雜交瘤細胞系。1986年，首次成功地用微囊化技術大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細胞來生產(chǎn)單克隆抗體。動物細胞的形態(tài)A、貼壁依賴型依賴型細胞的生長繁殖需要一個固體支撐物。體外培養(yǎng)時，依賴型細胞通過改變表面形態(tài)形成稱為“假足”的突出物，借以吸附在培養(yǎng)器皿內(nèi)壁或其他固體支撐物上。大多數(shù)動物細胞，包括非淋巴組織細胞和許多異倍體細胞和原核細胞均屬此類型。

1、成纖維細胞（fibroblast或mechanocytetype)2、上皮細胞（epithiliumcell)3、游走細胞（wonderingcell）4、多形性細胞（polymorphiccell)一、動物細胞的類型B、懸浮型或非貼壁依賴型非依賴型細胞能以懸浮的、游離的形態(tài)進行深層培養(yǎng)。來源于血液、淋巴組織的細胞和其他轉化細胞均屬于這一類型細胞，可采用類似于微生物培養(yǎng)的方式進行懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)時細胞呈圓形。二、動物細胞系的獲取和建立游離動物細胞的制備雜交細胞的獲得通過細胞融合技術，可將高效表達目標蛋白的異源細胞的遺傳物質(zhì)轉移至所選擇的可快速增殖的親本細胞中，獲得雜交細胞。PEG誘導融合和電場誘導融合是目前常用的細胞促融手段。雜交細胞的篩選篩選的機理是：將細胞融合后所得的各類型的細胞混合物接種于選擇性培養(yǎng)基上，終止同型雙核或多核融合子、異型多核融合子及未融合親本細胞的繁殖。目前最常用的篩選系統(tǒng)（或方法）有：HAT篩選系統(tǒng)、抗藥性篩選系統(tǒng)和營養(yǎng)互補篩選系統(tǒng)。生產(chǎn)用動物細胞的要求原代細胞二倍體細胞系轉化細胞系1、原代細胞是直接取自動物組織器官經(jīng)過粉碎消化而獲得的細胞懸液（109/g）。需要大量動物，費錢費勞力。雞胚細胞、原代兔腎細胞、鼠腎細胞、淋巴細胞。2、二倍體細胞系原代細胞經(jīng)過傳代篩選克隆，從多種細胞成分的組織中，挑選并純化出某種具有一定特征的細胞株。二倍體細胞有正常細胞的特點①染色體組型是2n核型；②貼壁依賴接觸抑制；③可傳代培養(yǎng)50代；④無致瘤性。3、轉化細胞系通過某個轉化過程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細胞特點，而獲得無限增殖能力。轉化過程可以是自發(fā)的、人工的、從動物腫瘤組織中建立。4、融合細胞系仙臺病毒融合法聚二乙醇融合法電融合法三、動物細胞培養(yǎng)特性比較項目微生物哺乳動物細胞植物細胞大小1－10μm10－100μm10－100μm懸浮生長可以多數(shù)細胞需貼壁生長可以，但易成團，無單個細胞營養(yǎng)要求簡單非常復雜較復雜生長速率快，倍增時間為0.5-5小時慢，倍增時間為15－100小時慢，倍增時間為24－74小時代謝調(diào)節(jié)內(nèi)部內(nèi)部、激素內(nèi)部、激素動植物細胞培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)的比較動植物細胞培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)的比較（續(xù)）比較項目微生物哺乳動物細胞植物細胞環(huán)境敏感性能忍受廣泛范圍非常敏感，僅忍受很窄范圍能忍受廣泛范圍細胞分化無有有剪切力敏感低非常高高傳統(tǒng)變異、篩選技術廣泛使用不常使用有時使用細胞或產(chǎn)物濃度較高低低四、動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)及過程控制培養(yǎng)基A、物理性質(zhì)1、pH值：正常成纖維細胞：pH7.4—7.7；轉化細胞：pH7.0—7.4。酚紅的呈色：

紫色■紅帶藍■紅色■橙色■黃色■呈色7.87.67.47.06.5pH2、溫度不同來源的動物細胞，其最適生長溫度不同。人和哺乳動物的最適生長溫度是37℃，而昆蟲細胞的最適生長溫度為25～28℃。動物細胞的培養(yǎng)溫度必須嚴格控制，允許波動范圍在±0.25℃之內(nèi)。3、通氣與攪拌溶解氧是細胞代謝所必需的。動物細胞培養(yǎng)過程中溶氧濃度必須適中，溶氧濃度過高可能對細胞產(chǎn)生毒害作用，但當溶氧濃度過低時，又成為細胞生長的限制因素。培養(yǎng)基B、血清1、常用血清：

小牛血清、胎牛血清、馬血清、人血清添加血清有助于細胞貼壁和生長。2、血清提供的主要成分：

蛋白質(zhì)、多肽、激素、代謝物和營養(yǎng)物、無機物天然培養(yǎng)基的優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好；缺點：來源有限，成分復雜，個體差異大。培養(yǎng)基C、合成培養(yǎng)基1、氨基酸2、維生素3、鹽4、葡萄糖5、有機添加劑6、激素和生長因素合成培養(yǎng)基的優(yōu)點：來源方便，標準化產(chǎn)品；缺點：不能完全滿足細胞的生長需求，通常還需要加入一定量的天然培養(yǎng)基予以補充。動物細胞的培養(yǎng)方式⒈懸浮培養(yǎng)讓細胞自由的懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖。⒉貼壁培養(yǎng)讓細胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁殖的培養(yǎng)方法。⒊貼壁-懸浮培養(yǎng)⑴微載體培養(yǎng)⑵包埋和微囊培養(yǎng)⑶結團培養(yǎng)1、懸浮培養(yǎng)適合非貼壁依賴細胞、兼性貼壁細胞操作簡便、培養(yǎng)條件均一、傳質(zhì)和傳氧較好、易擴大培養(yǎng)規(guī)模細胞體積小、難采用灌流培養(yǎng)、細胞密度低通氣攪拌罐式與氣升式生物反應器2、貼壁培養(yǎng)適合貼壁細胞、兼性貼壁細胞優(yōu)/缺點與懸浮培養(yǎng)相反在傳代或擴大培養(yǎng)時需要酶將細胞從基質(zhì)上消化下來（胰酶、二乙烯四乙酸鈉/EDTA、胰酶-檸檬酸鹽、胰酶-EDTA、膠原酶、鏈霉蛋白酶、木瓜酶等）3、貼壁-懸浮培養(yǎng)（1）微載體培養(yǎng)擴大貼附面積、保持懸浮狀態(tài)葡聚糖類、聚苯乙烯類、膠原類動物細胞微載體培養(yǎng)技術貼壁依賴型細胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷粘附和貼壁、生長及擴展成單層3個階段。提高細胞與微載體表面的相溶性，是提高細胞貼壁速率和貼壁比率的必要條件。動物細胞在生理pH條件下通常帶負電荷，微載體需采用特殊處理技術使顆粒表面帶正電荷，具可潤濕性。用血清蛋白或合成蛋白、聚糖氨酸等物質(zhì)包被于微載體表面，可以促進細胞貼壁。微載體有實心微載體和大孔微載體兩大類。大孔微載體培養(yǎng)動物細胞類似于包埋培養(yǎng)，細胞在孔內(nèi)生長，具有很高的安全性，攪拌引起的剪切損傷已不成為主要考慮的因素。理想微載體：表面性質(zhì)與細胞相容性好，