產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的分離與分布

產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的分離與分布

氫氧化產(chǎn)生的醋酸細(xì)菌在厭氧消化過程中發(fā)揮著重要作用，因為氫氧化產(chǎn)生的酸、蛋白質(zhì)和養(yǎng)分等代謝產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化為ch4前體酸、苯甲酸、b2、ch4等。認(rèn)識和了解產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的形態(tài)、組成、分布和豐度等特性對于研究有機(jī)物的生物降解和生物轉(zhuǎn)化過程中的微生物學(xué)機(jī)理等十分重要。Bryant等人在1967年發(fā)現(xiàn)并分離純化出了最早的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌株,此后,國內(nèi)外對產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的研究一直不斷。但是至今,產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的研究仍主要停留在傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方面,特別是計數(shù)方面,主要依賴以純培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的最大或然數(shù)方法(MostProbableNumber,MPN)。產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌是一類嚴(yán)格厭氧的真細(xì)菌,生長周期長,而且大部分產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌都是互營細(xì)菌,即其生長和代謝完全依賴于產(chǎn)甲烷細(xì)菌等其他微生物將代謝產(chǎn)物如H2的轉(zhuǎn)移和去除。因此,對產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)的研究時,要求極高的操作條件,耗時費力。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展,不依靠純培養(yǎng)的微生物群落結(jié)構(gòu)的分析方法已得到廣泛發(fā)展和應(yīng)用,如熒光原位雜交技術(shù)(FluorescenceInSituHybridization,FISH),這些方法能夠更加精確地揭示微生物種類和遺傳的多樣性等各方面的性質(zhì)。目前,通過分子生物技術(shù)對產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的研究極少,只有國外一些研究借助了膜雜交等分子生物學(xué)方法對其進(jìn)行過簡單的調(diào)查分析,國內(nèi)幾乎還沒有這方面的研究。本文以厭氧消化體系中產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌為研究對象,避免傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù),應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),建立并優(yōu)化了檢測產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的熒光原位雜交技術(shù),對幾種不同生境中的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌進(jìn)行定量監(jiān)測,其結(jié)果為了解產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌在某些厭氧生境中的分布和功能具有實際指導(dǎo)意義。1材料和方法1.1材料表面1.1.1污泥及消化因素在無錫地區(qū)6個地點進(jìn)行了采集取樣,包括(1)無錫某公司UASB反應(yīng)器中污泥;(2)太湖底泥;(3)城市下水道污泥;(4)無錫DSM檸檬酸廠IC反應(yīng)器污泥;(5)無錫奶牛場牛糞;(6)無錫城北污水處理廠消化污泥。采集的環(huán)境樣品立即進(jìn)行預(yù)處理。1.1.2探針和熒光染料食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針(S-F-Synm-0700-a-R-23)和食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針(S-S-S.wol-0223-a-R-19、S-S-MPOB-0222-a-R-19),其修飾合成均由上海生物工程有限公司完成;熒光染料DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)購自上海捷瑞科技有限公司。熒光顯微鏡(DXM1200C)為Nikon公司產(chǎn)品。1.2afmc乙方一定體積的環(huán)境樣品用磷酸緩沖液1ⅹPBS清洗2~3次后,與3倍體積的固定劑4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)充分混合,固定劑可以保護(hù)細(xì)胞的完整性,同時使探針容易滲透進(jìn)入細(xì)胞,與靶DNA序列結(jié)合。將加入4%PFA的樣品置于4℃,1~24h后,離心棄去固定劑,然后用1ⅹPBS清洗樣品,并將樣品重新懸浮于等體積的1ⅹPBS溶液中,最后用乙醇溶液,-20℃保存。1.3熱固定時間的影響取5μL適當(dāng)濃度稀釋的固定化細(xì)胞,均勻涂布于2孔白明膠包埋后的載玻片的每個孔上,在室溫下將載玻片晾干,再將載玻片置于46℃中熱固定20min,熱固定時間太長易引起細(xì)胞形態(tài)變化。將細(xì)胞依次在50%、80%和100%的乙醇溶液中脫水各5~15min,自然干燥。1.4食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針和探針的檢測方法產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育呈多樣性趨勢,分支眾多,至今描述的就有12個屬的19個種(亞種),很難用一種通用探針檢測到所有的目標(biāo)細(xì)胞。食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌和食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌是產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的常見細(xì)菌,針對這兩類細(xì)菌,采用了3種不同種屬水平的寡核苷酸探針,包括S-F-Synm-0700-a-R-23和S-S-S.wol-0223-a-R-19、S-S-MPOB-0222-a-R-19。探針S-F-Synm-0700-a-R-23幾乎可以和所有食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌靶序列結(jié)合,屬于屬水平檢測探針;探針S-S-S.wol-0223-a-R-19和探針S-S-MPOB-0222-a-R-19用于檢測食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌,屬于種水平的檢測探針。食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針用熒光染料花青素Cy3在3’端標(biāo)記;2種食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針都用熒光染料異硫氰酸熒光素FITC在3’端標(biāo)記。探針詳細(xì)情況見表1。1.5一般微生物檢測為確定樣品中產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌在總微生物中的相對豐度,采用熒光染料法對總微生物數(shù)量定量。1.6cy3、fic、daps熒光光譜在熒光顯微鏡Nikon(DXM1200C)不同激發(fā)波長下觀察,Cy3呈顯紅色熒光,FITC呈顯綠色熒光,DAPI呈顯藍(lán)色熒光。實驗中通過不同熒光信號分辨不同靶細(xì)胞,3種熒光染料的檢測條件如表2所示。1.7細(xì)菌豐度的測定—原位雜交,鏡檢和計數(shù)在載玻片的每個孔上加入10μL現(xiàn)配的雜交緩沖液(0.18mol/LNaCl,0.02mol/LTris/HCl(pH8.0),一定濃度的甲酰胺,每種探針的最適甲酰胺濃度通過實驗優(yōu)化確定),再加入1μL產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針使用液,加蓋玻片;在雜交管中放一張吸水紙,載玻片放入雜交管內(nèi),多余的雜交緩沖液傾于吸水紙上,46℃雜交1.5~3h。雜交完畢,迅速取出載玻片,放入48℃雜交洗脫液15~20min(0.02mol/LTris/HCl(pH8.0),0.005mol/LEDTA,一定濃度的NaCl(其濃度根據(jù)雜交緩沖液中甲酰胺濃度確定)),充分除去未雜交的探針和雜交緩沖液,盡量減少背景值,再用冰冷ddH2O漂洗2~3次,自然干燥。DAPI染色5min,再次自然干燥,蓋上蓋玻片,立刻在熒光顯微鏡下鏡檢,觀察視野取30次,用Image-ProPlus軟件計數(shù),樣品中細(xì)菌豐度由公式(1)計算得出,最后數(shù)據(jù)用MicrosoftOfficeExcel2003進(jìn)行統(tǒng)計分析。細(xì)菌豐度=視野中細(xì)菌數(shù)目×載玻片凹孔面積×稀釋倍數(shù)×固定樣品體積視野面積×涂布載玻片固定樣品體積×實際樣品體積(1)細(xì)菌豐度=視野中細(xì)菌數(shù)目×載玻片凹孔面積×稀釋倍數(shù)×固定樣品體積視野面積×涂布載玻片固定樣品體積×實際樣品體積(1)1.8實驗條件的優(yōu)化由于不同細(xì)菌和探針對FISH實驗條件要求不同,故需優(yōu)化FISH在檢測產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌時的實驗條件。由于文獻(xiàn)報道UASB反應(yīng)器中的生物多樣性高,同時所測定的3種靶菌群都有在其中檢出過,故選用華潤公司UASB污泥樣品,分別對樣品固定時間(fixationtime)、脫水時間(dehydratedtime)和甲酰胺濃度(formamideconcentration)3種影響雜交結(jié)果的主要因素進(jìn)行優(yōu)化。固定時間和脫水時間一般分別為1~24h和5~15min?？紤]到環(huán)境樣品雜質(zhì)較多,固定劑不容易作用于細(xì)胞,因此采用較長固定時間,在17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h8種固定時間中選擇最優(yōu)實驗條件。確定最佳固定時間后,再分別考察5、10、15min3種脫水時間,優(yōu)化脫水時間;最后,以5%為梯度在0%~65%濃度之間優(yōu)化選擇每種探針雜交最適甲酰胺濃度。1.9產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌檢測結(jié)果確定產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌檢測條件的基礎(chǔ)后,對采集的6種環(huán)境樣品進(jìn)行產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的檢測與比較,分析產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的數(shù)量和相對豐度等,對其主要生境等進(jìn)行探討。相同實驗條件下每份樣品重復(fù)檢測3次。實驗過程設(shè)置陰性對照:樣品進(jìn)行雜交,雜交液中不含探針。2結(jié)果和討論2.1種食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針的對比實驗結(jié)果固定樣品是FISH操作的第一個步驟。樣品固定失敗,探針就無法滲透進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞,而固定結(jié)果主要取決于固定時間,因此對樣品固定時間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明固定時間為19h時,樣品與3種探針結(jié)合都比較好,可在熒光顯微鏡下觀察到明顯的紅色和綠色熒光信號。與固定時間為19h的樣品比較,其他7種固定時間的樣品與3種探針結(jié)合能力都很弱,僅見到很黯淡的熒光信號。結(jié)果選取19h為最佳固定時間。脫水可以使探針更好地與細(xì)胞靶序列結(jié)合。脫水過程一般很容易被忽視,但是脫水過程的操作和脫水時間掌握不好,可能在FISH操作后觀察不到熒光信號。優(yōu)化脫水時間表明在每種乙醇溶液中脫水5min時熒光信號最為強(qiáng)烈,菌體分辨清晰,分布也較均勻。在FISH操作中,雜交緩沖液中甲酰胺濃度和洗脫液中NaC1濃度對結(jié)果都有一定影響。雜交緩沖液中甲酰胺濃度和洗脫液NaC1濃度過低或過高都會降低探針的特異性。甲酰胺濃度一般處于0~65%之間,并以5%為梯度進(jìn)行變化,雜交洗脫液中的NaCl濃度隨雜交緩沖液中甲酰胺濃度的變化而變化,兩者之間呈現(xiàn)一定的函數(shù)關(guān)系,因此在考察甲酰胺濃度的同時考察了洗脫液中NaCl濃度。選用不同的甲酰胺濃度時,使用食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針(S-S-S.wol-0223-a-R-19、S-S-S.wol-0223-a-R-19)進(jìn)行FISH操作后,發(fā)現(xiàn)熒光信號差別較大,在甲酰胺濃度為55%時2種食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針雜交后熒光信號相對較強(qiáng),觀察到明顯的綠色熒光,在其余甲酰胺濃度時熒光信號比較微弱。而應(yīng)用食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針(S-F-Synm-0700-a-R-23)進(jìn)行雜交,發(fā)現(xiàn)在選用不同甲酰胺濃度時熒光信號都比較強(qiáng),都會看到明亮的帶有紅色熒光的菌體,特別是選用15%、50%、55%、60%和65%濃度的甲酰胺時,觀察到明顯的帶有紅色熒光的菌體,但在60%和65%甲酰胺濃度時,熒光信號過于強(qiáng)烈,菌體過多,有可能是甲酰胺濃度為60%和65%時食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針的特異性降低,與食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌結(jié)合的同時也與其他的非食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌結(jié)合。結(jié)合食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針和食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針的總體情況,55%甲酰胺濃度最為適合選用。由此完成了FISH實驗條件優(yōu)化研究。選用最佳固定時間、脫水時間和甲酰胺濃度等因素進(jìn)行實驗才能得到好的雜交結(jié)果。采用優(yōu)化得出的最佳固定時間、脫水時間和甲酰胺濃度,對某公司UASB反應(yīng)器污泥樣品同時進(jìn)行3種探針的FISH操作,并進(jìn)行DAPI染色,結(jié)果如圖1所示,圖1中A、B、C分別是DAPI染色、食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針和食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針的雜交觀察結(jié)果,圖1.D由圖1.A、1.B、1.C經(jīng)過Image-ProPlus軟件合成得到,白色區(qū)域反映了與3種探針都有結(jié)合。Hansen和Harmsen曾經(jīng)分別運用膜雜交技術(shù)和原位雜交技術(shù)對生物反應(yīng)器中食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌或食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌進(jìn)行了考察。但是兩者選取的探針種類較少,檢測的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌種類和范圍狹窄,代表性差,尤其是Harmsen僅僅對一到兩種食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌株進(jìn)行了分析。更重要的是,對具體實驗操作條件交待不詳,無法考察探針的特異性,亦不能進(jìn)行重復(fù)實驗。而本文優(yōu)化得到的FISH技術(shù),采用多個種屬水平的特異性探針,摸索和提供了對產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌直接進(jìn)行原位分析的具體條件,提高了探針特異性,可以分別或同時檢測不同種類的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌;具有較強(qiáng)的可重復(fù)性。2.2不同基質(zhì)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的數(shù)量關(guān)系采用優(yōu)化得到的FISH檢測條件對6種環(huán)境樣品進(jìn)行了定量檢測,分析獲得的食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌、食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌、總產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌以及總微生物的數(shù)量,如表3所示。從表3可見,6種厭氧環(huán)境樣品中,食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌數(shù)量都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌數(shù)量,前者比后者大致高1個數(shù)量級。食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌含量最高的是來自UASB反應(yīng)器污泥,達(dá)到1.53×109cells/mL樣品,比其他5種樣品高1個數(shù)量級;其他5種樣品食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌含量大致相同。UASB污泥和奶牛場牛糞中都含有較多的食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌,DSM檸檬酸廠IC反應(yīng)器污泥和下水道污泥中的食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌含量處于同一數(shù)量級,太湖底泥中的食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌數(shù)量最少,比DSM檸檬酸廠IC反應(yīng)器污泥和奶牛場牛糞低了2個數(shù)量級。與此相對應(yīng),UASB污泥和奶牛場牛糞中總產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌數(shù)量最多,這說明這2種生境的生存條件比較理想,有利于產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的生長繁殖。不同環(huán)境樣品中產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌相對豐度不同,即占總微生物的比例不同,如圖2所示。圖2顯示,UASB污泥中食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌相對含量最高,占總微生物的18.7%,DSM檸檬酸廠IC反應(yīng)器污泥中食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌相對含量也比較高,占總微生物的1.89%,其他5中環(huán)境樣品中的食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌相對含量比率大致相同。食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌相對含量最高的是UASB污泥,其他環(huán)境樣品中的食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌相對含量都比較低?？偖a(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌相對豐度比較高的是UASB污泥和DSM檸檬酸廠IC反應(yīng)器污泥,分別為20.78%和2.04%,因為這2種生境中含有較高的糖量。比較食不同基質(zhì)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌種群的數(shù)量關(guān)系,發(fā)現(xiàn)每種樣品中食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌都比食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌數(shù)量高得多,這可能是由于食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針結(jié)合和檢測的細(xì)菌范圍廣于食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌探針的緣故。分析環(huán)境樣品,可以看到,廢水處理厭氧反應(yīng)器中含有較多的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌,尤其是處理含糖量較高的厭氧反應(yīng)器,糖轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸的數(shù)量多,基質(zhì)豐富,有利于產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的生存與增殖。反芻動物瘤胃中也生存有一定量的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌,數(shù)量也比較多。相比較而言,湖底沉積物中產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌數(shù)量最少。本文運用FISH技術(shù),定量了多種不同種類的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌;同時,調(diào)查了多種厭氧環(huán)境中產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的情況,對于反映這類細(xì)菌在不同生境中的生存、分布和數(shù)量等信息提供了參考。而Hansen和Harmsen主要了解了產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌和其互營細(xì)菌甲烷細(xì)菌之間的相互關(guān)系等,并沒有對產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌進(jìn)行定量等其他方面的分析,且考察的生境很少,基本只涵蓋了厭氧生物反應(yīng)器。所以,本研究采用的FISH技術(shù)彌補(bǔ)了Hansen和Harmsen研究的這一缺陷。2.3兩組方法比較為進(jìn)一步檢測本文所建FISH方法的準(zhǔn)確性和可行性,對建立的FISH方法和其他文獻(xiàn)報道的其他方法檢測產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的結(jié)果進(jìn)行了比較,如表4所示。國內(nèi)外專門針對產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的定量研究都比較少,所報道的產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌計數(shù)方法絕大多數(shù)采用了MPN法[16~18]。竺建榮等人應(yīng)用MPN方法計數(shù)得到的UASB反應(yīng)器污泥中產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌的數(shù)量是4.3×108個/mL。一般來講,不同來源的樣品之間可比性不高,其差異也不一定就是方法造成的,為了對兩種方法進(jìn)行比較,選擇與此相對應(yīng)的幾乎相同的生境和樣品對比發(fā)現(xiàn),本文采用FISH方法檢測到的UASB反應(yīng)器污泥中產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌數(shù)量是1.70×109cells/mL樣品,其中食丁酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌和食丙酸鹽產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌分別為1.53×109cells/mL樣品、1.70×108cells/mL樣品,比竺建榮等人檢測到的4.3×108個/mL高1個數(shù)量級。這可能主要因為產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌是嚴(yán)格厭氧細(xì)菌,不能在純培養(yǎng)條件下很好的生長,部分產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細(xì)菌甚至不能在純培養(yǎng)條件下生長,需要與耗氫菌互營才能良好生長,這