一種抗-人絨膜促性腺激素的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

一種抗-人絨膜促性腺激素的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析方法

人類鹿皮素（hcg）是糖蛋白激素家族的成員之一。該家族成員還包括LH、FSH、TSH,都是由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基組成的異二聚體。其中α亞基含有92個(gè)氨基酸,為糖蛋白激素家族成員所共有;β亞基決定了各成員的生物學(xué)活性,并在各成員間顯示了廣泛的同源性。在HCG和LH的β亞基之間,二者的同源性為80%。HCG的β亞基含有145個(gè)氨基酸,LH的β亞基含有121個(gè)氨基酸,二者的不同在于C末端的24個(gè)氨基酸。HCG的相對(duì)分子質(zhì)量為37500,其中α亞基的相對(duì)分子質(zhì)量為14000,β亞基的相對(duì)分子質(zhì)量為23500。目前,在臨床診斷中建立快速、靈敏的HCG測(cè)定方法是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。已經(jīng)報(bào)道的方法有放射免疫分析、電化學(xué)免疫分析、時(shí)間分辨免疫熒光分析等,但這些方法具有核輻射危害、敏感性差、可定量測(cè)定范圍窄、需要反復(fù)清洗與分離、檢測(cè)耗時(shí)長、自動(dòng)化程度不高等缺點(diǎn)。我們開發(fā)了β-HCG的光激化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(lightinitiatedchemiluminescentassay,LICA),通過引入激光技術(shù)與納米微粒技術(shù),成功地解決了上述不足。反應(yīng)在均相進(jìn)行,既加快了反應(yīng)速度,又避免了反復(fù)分離與清洗步驟,能有效降低檢測(cè)背景值,減少反應(yīng)時(shí)間,并可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。材料和方法一、儀器、試劑和儀器人β-HCG單克隆抗體(1號(hào)和3號(hào))由博陽生物科技(上海)有限公司抗原抗體組提供。發(fā)光微粒由博陽生物科技(上海)有限公司微粒組(ATG)提供。LICA通用液系LICAHT光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀的配套試劑。TSH、FSH和LH購自中國藥品生物制品檢定所。生物素購自Sigma-Aldrich公司。精制馬血清購自上海普龍生物技術(shù)研發(fā)有限公司。二奎啉甲酸(BCATM)法蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購自ThermoFisherScientific公司?；颊邩颖?0份,為中國福利會(huì)國際和平婦幼保健院提供的β-HCG定值血清。96孔微孔板為LICAHT高通量均相發(fā)光免疫分析儀配套專用板。二、基于licasp的全自動(dòng)移液器LICAHT高通量均相發(fā)光免疫分析儀、LICASP全自動(dòng)移液器由上海博陽醫(yī)療儀器有限公司提供;粒徑儀為島津SALD-7101激光衍射式粒度分布測(cè)量?jī)x。三、實(shí)驗(yàn)方法1.單抗wt-l的制備取適量發(fā)光微粒,微粒表面帶有活性醛基基團(tuán),粒徑約為150nm,經(jīng)離心處理,超聲分散至0.1mol/L磷酸緩沖液(pH值7.0)中,以10∶4(W/W)的比例加入1號(hào)β-HCG單克隆抗體,加入上述反應(yīng)液體積的1%的40mg/mL三氫硼氰化鈉(NaCNBH3)催化,37℃旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)48h,進(jìn)行離心,清洗未反應(yīng)的單抗,之后將其定容至100μg/mL,4℃保存?zhèn)溆谩?.生物素改性的制備取3號(hào)β-HCG單克隆抗體,將其溶液的pH值調(diào)整為8.5,以1∶30(摩爾比)的比例加入生物素(Biotin),4℃混合反應(yīng)過夜,之后將未反應(yīng)的生物素進(jìn)行透析處理,將其定容至7μg/mL,4℃保存?zhèn)溆谩?.血清系列的標(biāo)定將一份經(jīng)Beckman-coulterAccess[化學(xué)發(fā)光法(CLIA)]系統(tǒng)定值的β-HCG患者混合樣本用馬血清系列稀釋,配制成0、5、25、150、500、1000mIU/mL的β-HCG標(biāo)準(zhǔn)液,然后再使用Beckman-CoulterAccess(CLIA)系統(tǒng)對(duì)每個(gè)稀釋液進(jìn)行標(biāo)定,標(biāo)定合格后,分裝成每管1mL,在離心管上標(biāo)注批號(hào)、名稱、濃度、體積、制備人和日期等信息,并將其保存在-20℃?zhèn)溆谩?.lica通用液微粒的動(dòng)態(tài)在均相條件下將內(nèi)部帶有染料的LICA通用液微粒以及包被有活性分子并且內(nèi)部帶有發(fā)光化合物的發(fā)光微?；旌衔锖蜋z測(cè)樣本混合。此時(shí)LICA通用液微粒和包被有活性分子的發(fā)光微?？裳杆儆行У夭蹲桨蟹肿硬⑿纬擅庖邐A心復(fù)合物。外部激發(fā)光照射后,LICA通用液微粒中的染料被誘導(dǎo)激活,并釋放高能態(tài)的單線態(tài)。該高能態(tài)的活性氧被近距離的發(fā)光微粒俘獲,傳遞能量以激活所述發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物。數(shù)微秒后,發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物將釋放出高能級(jí)紅光。用光子計(jì)數(shù)器測(cè)定這些高能級(jí)光子,得到相對(duì)光量子單位(RLU)值。5.licaht光激化學(xué)發(fā)光探測(cè)法檢測(cè)ca-ld在96孔微孔板中,每孔依次加入標(biāo)準(zhǔn)品或者待測(cè)樣本25μL、100μg/mL免疫發(fā)光微粒試劑25μL、7μg/mL生物素標(biāo)記試劑25μL,將微孔板置于LICAHT光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀內(nèi),儀器程序設(shè)定為37℃溫育1200s,然后儀器自動(dòng)加入LICA通用液175μL,37℃溫育900s,讀取光信號(hào)RLU值。四、檢測(cè)方法的性能評(píng)價(jià)1.開口靈活2.返回率3.精密度4.特異性5.穩(wěn)定性6.與beckmancorder試劑的相關(guān)性結(jié)果一、粒徑檢測(cè)結(jié)果將經(jīng)過徹底清洗的免疫發(fā)光微粒用發(fā)光試劑緩沖液定容至10mg/mL,取樣在粒徑儀上測(cè)定微粒粒徑,測(cè)得的粒徑結(jié)果為152nm(CV=8.3%)。二、標(biāo)簽識(shí)別抗法穩(wěn)定性將透析好的標(biāo)記抗體吸出轉(zhuǎn)移至干凈離心管中,取樣以BCA法測(cè)定抗體濃度。三、標(biāo)準(zhǔn)品濃度和rlu值的擬合將制備得到的標(biāo)準(zhǔn)品用Beckman-CoulterAccess(CLIA)系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)定,各個(gè)濃度的測(cè)定值與理論值見于表1。配制的β-HCG標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過Beckman-CoulterAccess(CLIA)系統(tǒng)標(biāo)定后,得到的實(shí)測(cè)濃度和理論濃度的比值在0.9～1.1之間,符合要求。將標(biāo)準(zhǔn)品濃度和RLU值分別取以10為底的對(duì)數(shù),然后以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),以RLU值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和RLU值進(jìn)行雙對(duì)數(shù)直線回歸擬合,r=0.997。表明該檢測(cè)方法的線性較好,得到的曲線見圖1。四、不同批次試劑的靈敏度采用建立的LICA測(cè)定靈敏度。用3個(gè)批次的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行試驗(yàn),得到的靈敏度分別為0.16、0.15、0.17mIU/mL,xˉxˉ為0.16mIU/mL,s為0.01,3個(gè)批次試劑的CV為7.56%。五、回收率和收率3份加入不同濃度β-HCG樣本的測(cè)定結(jié)果分別為12、176和469mIU/mL,回收率分別為101.7%、96.3%和102.9%,平均為100.3%。六、血清批內(nèi)cv測(cè)得的精密度見表2、表3。高、中和低值質(zhì)控血清的批內(nèi)CV為0.80%～3.99%,平均為1.90%。批間CV分別為0.72%、4.03%和2.00%,平均為2.25%。七、tsh對(duì)-hcg檢測(cè)的干擾250mIU/mLLH、150mIU/mLFSH和300μIU/mLTSH可以產(chǎn)生的交叉反應(yīng)量分別為3.1、2.4和0.8mIU/mL,均<5.0mIU/mL,這三者對(duì)β-HCG的檢測(cè)干擾較小,見表4。八、可靠性研究將在4℃存放3個(gè)月、37℃存放7d的試劑取出,對(duì)其進(jìn)行物理檢查,并在線性、靈敏度、精密度方面考察其穩(wěn)定性,結(jié)果見表5。九、種檢測(cè)方法對(duì)于測(cè)定2種檢測(cè)方法的比對(duì)分別用LICA法和化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)80份患者血清樣本β-HCG濃度,結(jié)果顯示2種檢測(cè)方法具有較好的相關(guān)性。相關(guān)性曲線見圖2,相關(guān)性方程為Y=1.0513X-0.568,r=0.996,符合斜率在0.9～1.1之間、截距<1.0、r值>0.99的要求。hcg的跨界方法本研究采用LICA,用Biotin標(biāo)記和雙抗體夾心法,建立起測(cè)定β-HCG的方法,并對(duì)其進(jìn)行了多項(xiàng)指標(biāo)的考核。結(jié)果表明,LICA的本底低、靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好、分析時(shí)間短(僅為45min)。在4℃存放3個(gè)月、37℃存放7d的試劑外觀目測(cè)沒有變化,在線性、靈敏度、精密度方面也和新制備的試劑沒有明顯差異,所以該試劑的穩(wěn)定性佳。LICA的分析靈敏度為0.16mIU/mL,低于市場(chǎng)上同類產(chǎn)品的靈敏度(0.5mIU/mL),從而使得本方法的適應(yīng)性更廣,也可以給HCG的快速診斷方法學(xué)建立提供參考。本法的回收率高,在90%～110%之間;質(zhì)控血清的批內(nèi)和批間CV均<5%,具有很好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)中采用的單抗針對(duì)的是HCG的β亞基。所以,本法的交叉反應(yīng)率低,特異性強(qiáng)。本法與化學(xué)發(fā)光法的相關(guān)性較好,得到的相關(guān)性曲線的斜率接近于1,截距<1,r值為0.996。在人體內(nèi),婦女妊娠時(shí)HCG水平會(huì)大幅升高,HCG在受孕后6～8d產(chǎn)生,在妊娠的前8周增長很快,以維持妊娠,50～80d達(dá)到高峰,以后逐漸下降,直到孕20周達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。一般來講,多胎妊娠的血清HCG水平要高于單胎妊娠。妊娠異常時(shí),如唐氏綜合征妊娠、葡萄胎妊娠,母體血清的HCG水平同樣異常于正常妊娠,本法同樣適用于該類異常妊娠的診斷。重復(fù)測(cè)定20孔0mIU/mL標(biāo)準(zhǔn)品,計(jì)算這20孔的RLU均值()和標(biāo)準(zhǔn)差(s),以反代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到的濃度值即為分析靈敏度,采用不同批次的試劑和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3次該實(shí)驗(yàn),求得的即為本檢測(cè)方法的靈敏度。取一份已知濃度(β-HCG濃度為15.4mIU/mL)的患者血清,分成等體積的3份,分別等體積加入濃度為8.2、350.0和896.0mIU/mL的β-HCG樣本并測(cè)定其濃度,與其理論濃度進(jìn)行比較,計(jì)算每份回收率?；厥章?[(實(shí)測(cè)值-基質(zhì)值)/理論值]×100%。用正常人血清制成高、中、低質(zhì)控血清,期望濃度分別為820、390和14mIU/mL,測(cè)定該質(zhì)控血清濃度,將高、中、低質(zhì)控血清各平行做10孔,計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)(CV),連續(xù)測(cè)定3d,計(jì)算批間CV。將LH、FSH和TSH溶解于馬血清中,配制成5000mIU/mL(LH)、3000mIU/mL(FSH)和6000μIU/mL(TSH)的儲(chǔ)備液。各取50μL儲(chǔ)備液加入950μL馬血清,分別制備成250mIU/mL(LH)、150mIU/mL(FSH)和300μIU/mL(TSH)的測(cè)試樣本。對(duì)照樣本為馬