aa染色體組野生稻種遺傳多樣性及遺傳關系分析

aa染色體組野生稻種遺傳多樣性及遺傳關系分析

水稻是世界上最重要的糧食和最古老的糧食之一。世界上1.2%以上的人口主要以水稻為食。近年來,由于改良品種的廣泛應用和育種者對親本選擇的偏好,造成水稻遺傳基礎狹窄和遺傳脆弱性問題日漸突出。據(jù)估計,從野生稻中發(fā)掘抗病蟲基因的幾率約為栽培稻的50倍,而且野生稻可能是某種病蟲害的惟一抗源。因此,發(fā)掘利用野生稻有利基因,拓寬栽培稻遺傳基礎,已引起水稻育種家的普遍關注。研究表明,稻屬種間形態(tài)性狀和基因型高度分化為10種染色體組型,即AA、BB、CC、BBCC、CCDD、EE、FF、GG、HHJJ和HHKK,其中亞洲栽培稻(O.sativaL.)、非洲栽培稻(O.glaberrimaSteud.)、巴蒂野生稻(O.barthiiA.Chev.)、展穎野生稻(O.glumaepatulaSteud.)、長雄蕊野生稻(O.longistaminataChev.etRoehr.)、南方野生稻(O.meridionalisNg.)、一年生野生稻(O.nivaraSharmaetShastry)、普通野生稻(O.rufipogonGriff.)和一年生雜草稻(O.spontanea)同屬分布甚廣的稻屬AA染色體組,其中兩個栽培種間親緣關系較近。目前,國內外許多學者已用等位酶、RFLP、RAPD、AFLP、SSR和ISSR等標記研究稻屬尤其是普通野生稻和栽培稻間多樣性及其演化關系,取得了明顯進展,但對其AA染色體組種間多樣性及其與典型栽培稻間的系統(tǒng)報道甚少,普通野生稻(O.rufipogon)、尼瓦拉野生稻(O.nivara)和一年生雜草稻(O.spontanea)間的遺傳關系仍存在爭議。因此,本研究選用均勻分布于水稻12條染色體上多態(tài)性較好的30對SSR引物,研究來自不同國家和地區(qū)的稻屬AA染色體組8個種(類型)42份材料的遺傳多樣性及其親緣關系。這不僅有利于提高稻屬AA染色體組優(yōu)異基因的利用效率,也為資源鑒定、保護和育種利用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1稻蠶、縣生物多樣性品種種選取稻屬AA染色體組代表性強的8個種(類型)共42份材料(表1),其中亞洲栽培稻秈、粳亞種各5個品種;非洲栽培稻、巴蒂野生稻、展穎野生稻、長雄蕊野生稻、一年生野生稻、一年生雜草稻和部分普通野生稻來自國際水稻研究所,其余材料由中國水稻研究所種質庫提供。1.2核矩陣dna提取在分蘗盛期取幼葉頂部約2cm,按鄭康樂等的DNA微量提取法進行DNA的提取和純化。1.3pcr反應體系選取均勻分布于12條染色體上多態(tài)性較好的30對引物進行SSR分析。所有引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,具體引物及所屬染色體列于表2。采用MJResearch公司的PTC-200擴增儀進行PCR擴增。采用10μL反應體系,包括:4.1μLddH2O,1μL10×PCRBuffer,0.8μLMgCl2(25mmol/L),1μLdNTPs(2.0mmol/L),1μL引物(33μg/mL),0.1μLTaq酶(5U/μL),1μLDNA模板(30~50ng/μL)。反應程序為:94℃下預變性1min,94℃下45s,55℃下45s(退火溫度隨引物而變),72℃下1min,30個循環(huán),最后72℃下延伸8min,10℃保溫。擴增產物在2.5%的Metaphor瓊脂糖凝膠上電泳分離,用溴化乙錠(EB)染色檢測。若同一引物在不同的材料上呈現(xiàn)出兩個或兩個以上遷移率不同的帶,視為具有多態(tài)性,該引物則為多態(tài)性引物。1.4平均工藝矩陣SSR是共顯性標記,同一引物擴增產物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性。每個SSR引物作為一個位點,視每一擴增條帶為一個性狀,有此帶記為1,沒有的記為0。按照帶的有無構建多態(tài)性條帶個數(shù)和材料之間的二進制矩陣,將1/0形式進行數(shù)據(jù)轉換。應用POPGENE32統(tǒng)計軟件,計算多態(tài)性位點百分率(P)、等位基因觀察數(shù)(A)、S,Shortarmofchromosome;L,Longarmofchromosome.等位基因有效數(shù)(Ae)、Shannon多樣性指數(shù)(I)、Nei基因多樣性指數(shù)(He)及Nei遺傳距離。根據(jù)Nei遺傳距離采用Statistica6.0統(tǒng)計軟件,按非加權配對算術平均法(unweightedpairgroupmethodwitharithmeticaveraging,UPGMA)進行聚類,分析個體間及種間的遺傳關系。2結果與分析2.1引物等位基因檢測選用的30對SSR引物,在稻屬AA染色體組42份材料中均檢測出多態(tài)性(圖1),多態(tài)性位點百分率(P)為100%。30對引物在42份材料中共檢測到224個等位基因,變幅為3~10個,平均為7.47個;平均等位基因有效數(shù)(Ae)為5.45個。Nei基因多樣性指數(shù)(He)和Shannon多樣性指數(shù)(I)都以引物RM167最大(分別為0.888和2.386)、RM192最小(分別為0.199為0.454),即RM167具較高的多態(tài)性檢測效率。2.2非洲栽培稻間ssr標記及等位基因信息分析在稻屬AA組42份材料中,亞洲栽培稻(O.sativa)與一年生野生稻(O.nivara)、普通野生稻(O.rufipogon)和一年生雜草稻(O.spontanea)在所用的30對引物中相同帶型居多,尤其是與普通野生稻的共同帶型高達7對,占總標記的23.4%,提供了亞洲栽培稻源于普通野生稻的又一證據(jù);非洲栽培稻(O.glaberrima)則與原產非洲的巴蒂野生稻(O.barthii)和長雄蕊野生稻(O.longistaminata)具有較多的共同帶,其中,與巴蒂野生稻有共同帶型的標記數(shù)為11對,與長雄蕊野生稻具有共同帶型的標記數(shù)為4對,這顯示巴蒂野生稻是非洲栽培稻的祖先種。30對SSR引物中,RM225、RM228和RM13標記在非洲類群(非洲栽培稻、巴蒂野生稻和長雄蕊野生稻)間具有較一致的等位基因;RM246、RM71、RM16、RM13、RM201、RM244、RM19、RM30、RM10、RM21、RM22、RM225、RM250和RM70標記則在亞洲類群(亞洲栽培稻、一年生野生稻、普通野生稻、一年生雜草稻)間具有較多的相同等位基因;RM1和RM70標記在南美類群間等位基因較一致。這表明了稻屬AA染色體組8個種(類型)間存在SSR標記的地理特異性差異。對稻屬AA染色體組8個種(類型)42份試驗材料用30對SSR引物分析,計算Nei遺傳距離并作UPGMA聚類(圖2)。以遺傳距離1.2為閾值時分成三大類:第一類為非洲類群,共7份,其中3份巴蒂野生稻、2份非洲栽培稻和2份長雄蕊野生稻,均原產于非洲。第二類為亞洲類群,共34份,其中32份為原產亞洲的亞洲栽培稻、一年生野生稻、普通野生稻和一年生雜草稻,2份為非洲栽培稻。我們發(fā)現(xiàn)這2份非洲栽培稻不僅含有僅存在于亞洲栽培稻RM16、RM343和RM20等標記的等位基因,還檢測到RM21的非洲栽培稻特異性等位基因,這可能與亞洲栽培稻西非種植與非洲栽培稻間基因交流有關。第三類為南美類群,僅1份,獨立于非洲和亞洲類群,為原產委內瑞拉的展穎野生稻。表3顯示,亞洲栽培稻與普通野生稻遺傳距離最小(0.5087),而非洲栽培稻則與巴蒂野生稻親緣最近(Nei遺傳距離0.6161),再次證實了普通野生稻和巴蒂野生稻分別是亞洲栽培稻和非洲栽培稻的祖先種。2.3與亞洲栽培稻、東南角稻的關系一年生雜草稻(O.spontane)最早指一年生草本野生種。圖2揭示了一年生雜草稻與稻屬AA染色體組種間的系統(tǒng)關系。當遺傳距離為1.0時可分為11類,其中6份一年生雜草稻(O.spontanea)有5份(CNW148、149、150、151、194)與2份非洲栽培稻(BARTATAZC和IRGC103525)、2份普通野生稻(CNW217、242)屬同一亞類,另1份(CNW146)與8份亞洲栽培稻(5份秈亞種和3份粳亞種)、1份廣西普通野生稻(GX-3000)以及2份一年生野生稻(CNW163、164)屬同一亞類,上述2亞類又與2份一年生野生稻(CNW176、177)歸為一類。這表明一年生雜草稻既有與栽培稻相近的類型,也有與普通野生稻、一年生野生稻相近的類型。一年生雜草稻與亞洲栽培稻和普通野生稻遺傳距離較小,分別為0.5142和0.6734;與一年生野生稻和非洲栽培稻遺傳距離居中,分別為0.7437和1.0238;與其他3個種的遺傳距離較遠,為1.2159~1.5560(表3)。這為一年生雜草稻地位提供了依據(jù)。另外,它在RM16、RM343、RM192、RM10、RM216、RM219、RM225、RM1、RM273等11個標記中有特征帶,占總標記數(shù)的36.7%;其中RM192標記為亞洲栽培稻和一年生雜草稻的共同帶;RM343和RM273標記在亞洲栽培稻、一年生雜草稻和一年生野生稻出現(xiàn)共同帶。這與以往研究結果認為O.spontanea是栽培稻、野生稻之間漸滲雜交后代在田間形成的雜草稻相一致。3討論3.1稻屬aa染色體多態(tài)性用2.5%Metaphor瓊脂糖凝膠電泳可揭示稻屬AA染色體組8個種(類型)間42份材料30個SSR標記的遺傳多樣性,即SSR標記具有高度的多態(tài)性。因此SSR標記是一種研究稻屬AA染色體組種間遺傳多樣性的有效方法;SSR標記無論在栽培稻還是野生稻中都具有較高的多態(tài)性。這與以往的研究結果大體相符。3.2與aa染色體組稻的距離對稻屬的分類研究早在19世紀末期就已開始,至今稻屬的各種染色體組型已全部確定,并基本清楚了野生稻不同基因組種間的親緣關系,但是在某些種的確定及親緣關系上仍存在很大分歧,特別是AA染色體組栽培稻和野生稻之間以及普通野生稻、一年生野生稻和一年生雜草稻之間的親緣關系。大量研究顯示亞洲栽培稻與多年生普通野生稻的親緣關系最近,而非洲栽培稻則與巴蒂野生稻關系最密切,普通野生稻和巴蒂野生稻分別被認為是亞洲栽培稻和非洲栽培稻的野生祖先種[4,6,7,8,9,10,11,20],我們的研究結果也證實了這一結論。由于亞洲栽培稻、普通野生稻與一年生野生稻間親緣相近,幾乎不存在生殖隔離,盧寶榮等曾建議將該三個種合并為一個種。在我們的結果中,亞洲栽培稻、普通野生稻與一年生野生稻三者間具有很近的遺傳距離(表3),但是否可以作為一個種處理還有待深入研究。由于展穎野生稻與普通野生稻在形態(tài)上差異明顯、種間雜種結實率僅為0%~25%以及存在地理隔離,Morishima和Chang將展穎野生稻定為獨立的種;而Tateoka、Second、Vaughan則認為展穎野生稻是普通野生稻引入南美的類型,可與普通野生稻合并為一個種。在我們的研究中,展穎野生稻與AA染色體組內其他種的遺傳距離較大,聚類獨立,是一個獨立的種。Ge等發(fā)現(xiàn)展穎野生稻與非洲類群親緣較近。但在我們的結果中,展穎野生稻與亞洲類群的距離并不比非洲類群的大(表3),這可能與研究方法和材料的差異有關。長雄蕊野生稻具有較強的生殖隔離,與其他近緣種雜交相對較難。RFLP結果表明,長雄蕊野生稻是較早從O.sativa群的