【公開(kāi)課】重組DNA技術(shù)的基本工具課件高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

提取抗蟲(chóng)基因棉花細(xì)胞蘇云金芽孢桿菌(有抗蟲(chóng)特征)

普通棉花

(無(wú)抗蟲(chóng)特征)基本工具？(含抗蟲(chóng)基因)

棉花植株(有抗蟲(chóng)特征)培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程基因工程：是指按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物制品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫

重組DNA技術(shù)1.原理：2.操作對(duì)象：3.操作水平：4.結(jié)果：基因分子水平基因重組賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物制品科技探索之路定向改造生物性狀；克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙5.意義：例1.人的胰島素基因能通過(guò)拼接并在受體細(xì)胞大腸桿菌中表達(dá)出相

同蛋白質(zhì)——胰島素的理論基礎(chǔ)是？（1）大腸桿菌和人的遺傳物質(zhì)都是______

。（2）不同生物的DNA分子能夠拼接在一起，原因是

____________________________________

。

（3）同一種基因在不同生物體內(nèi)表達(dá)出來(lái)的蛋白質(zhì)相同，因?yàn)?/p>

_____________________________________

。（4）遺傳信息的傳遞都遵循_______

。DNA中心法則基因的組成、空間結(jié)構(gòu)和堿基互補(bǔ)配對(duì)方式相同所有生物共用一整套遺傳密碼科技探索之路

到社會(huì)中去工具分子手術(shù)刀分子縫合針?lè)肿舆\(yùn)輸車(chē)限制性?xún)?nèi)切核酸酶：DNA連接酶：載體：準(zhǔn)確切割DNA分子將DNA片段連接起來(lái)將體外重組好的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞

DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專(zhuān)門(mén)的“分子工具”。那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？（1）來(lái)源:（2）功能:1.限制酶一.重組DNA技術(shù)的基本工具磷酸二酯鍵切點(diǎn)

從微生物(主要是原核生物)體內(nèi)分離出來(lái)

能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。

具有專(zhuān)一性。（消耗水）（3）切割結(jié)果：黏性末端和平末端1.限制酶一.重組DNA技術(shù)的基本工具限制酶所識(shí)別序列的特點(diǎn)是：一條鏈從5’往3’讀的堿基順序與另一條鏈從5’往3’讀的順序完全一致。呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對(duì)稱(chēng)，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線(xiàn)，中軸線(xiàn)兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ(chēng)重復(fù)排列的學(xué)以致用1.形成的黏性末端（從5’往3’讀）為_(kāi)_______2.一個(gè)限制酶切割一次斷兩個(gè)磷酸二酯鍵形成___個(gè)黏性末端3.同一種限制酶切割形成的黏性末端________4.兩個(gè)黏性末端有___個(gè)游離的磷酸基團(tuán)AATT兩相同25’3’3’5’不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端限制酶存在于原核生物中的作用是什么?原核生物容易受到外源DNA的入侵限制酶為什么不會(huì)剪切原核生物本身的DNA?DNA分子中不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列,或者DNA

分子被修飾（甲基化），使限制酶不能將其切開(kāi)【旁欄思考1】限制酶的作用:切割外源DNA,使之失效保證自身的安全限制酶切質(zhì)粒EcoRⅠ切割質(zhì)粒思考：要想把目的基因插入缺口，需對(duì)目的基因作何處理？用同種限制酶切割目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端重組質(zhì)粒DNA連接酶連接【思考2】用限制酶切割時(shí)需注意的事項(xiàng)(1)獲取目的基因和切割載體時(shí),通常使用同種限制酶,目的是_____

。但是使用該法缺點(diǎn)是容易發(fā)生

______________

，為了避免上述

情況發(fā)生,可采取的措施是__

_____

.(2)獲取一個(gè)目的基因需限制酶切割

次,共產(chǎn)生

個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。為了產(chǎn)生相同的黏性末端，便于連接兩4分別使用兩種限制酶去切割目的基因和運(yùn)載體目的基因、質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因與質(zhì)粒反向連接

將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，形成重組DNA分子。(1)作用:(2)分類(lèi)種類(lèi)E·coli

DNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能特性相同點(diǎn)大腸桿菌T4噬菌體只能將具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來(lái)，不能連接具有平末端的DNA片段既可以連接雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA片段的平末端（但連接平末端的效率相對(duì)較低）恢復(fù)的都是磷酸二酯鍵一.重組DNA技術(shù)的基本工具2.DNA連接酶

旁欄思考（P72）：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？DNA連接酶DNA聚合酶不需要模板需要DNA的一條鏈為模板兩個(gè)DNA片段之間脫氧核苷酸和DNA片段之間基因工程DNA復(fù)制不同點(diǎn)模板作用部位作用結(jié)果用途一.重組DNA技術(shù)的基本工具2.DNA連接酶①化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)②都是催化形成磷酸二酯鍵相同點(diǎn)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體---分子運(yùn)輸車(chē)一.重組DNA技術(shù)的基本工具將外源基因送入受體細(xì)胞。1.作用：2.種類(lèi)：來(lái)源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別種類(lèi)用途不同點(diǎn)質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動(dòng)物病毒將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細(xì)胞將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞將外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞3.作為運(yùn)載體需具備的條件:

①___

_．

②__________

．

③

．

④__

等．能夠在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定保存

有1個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接具有標(biāo)記基因（最好多個(gè)），便于進(jìn)行篩選對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害質(zhì)粒3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體---分子運(yùn)輸車(chē)①它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的

_____

，故質(zhì)粒有

個(gè)游離的磷酸基團(tuán)②氨芐青霉素抗性基因在質(zhì)粒DNA上稱(chēng)為_(kāi)___

，還有如：卡那霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因等；

其作用是________________。環(huán)狀雙鏈DNA分子0標(biāo)記基因?qū)⒑心康幕虻氖荏w細(xì)胞篩選出來(lái)③復(fù)制原點(diǎn)：_______________

。DNA分子復(fù)制的起點(diǎn)在進(jìn)行基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的

基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的。2023/10/4例1.選用下圖載體將目的基因?qū)爰?xì)菌中并將含有目的基因的細(xì)菌篩選出來(lái)。（1）在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中添加抗生素B，則應(yīng)該選擇的限制酶為_(kāi)______。（2）在培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)基中添加抗生素A，則應(yīng)該選擇的限制酶為_(kāi)____。①或②①思考：λ噬菌體的衍生物或某些動(dòng)植物病毒作為運(yùn)載體利用的原理是

___

.病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵染具有一定

的

__

性。利用病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵染性物種（組織）特異【例2】若用家蠶作為某基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，在噬菌體和昆蟲(chóng)病毒兩種載體中，不選用

作為載體，其原因是

。噬菌體噬菌體的宿主細(xì)胞是細(xì)菌，而不是家蠶霍亂弧菌中含有質(zhì)粒，但

（填“能”、“不能”）用來(lái)做載體，因?yàn)檫x擇的載體應(yīng)該

。對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害不能HindIII和EcoRI下列操作中選用哪種限制酶切割來(lái)構(gòu)建重組質(zhì)粒？各抒己見(jiàn)…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…

GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG2023/10/4思考·討論·重組DNA分子2023/10/41.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對(duì)?如果不能，可能是什么原因造成的？3.你插入的DNA片段能稱(chēng)得上一個(gè)基因嗎？

剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。思考·討論·重組DNA分子

如果制作的黏性末端的堿基不能互補(bǔ)配對(duì)，可能是剪切位點(diǎn)或連接位點(diǎn)選得不對(duì)，也可能是其他原因。

不能，因?yàn)榛虻拈L(zhǎng)度一般在100個(gè)堿基對(duì)以上。探究-實(shí)踐DNA的粗提取與鑒定（一）基礎(chǔ)知識(shí)利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)上的差異，提取DNA，去除其他成分。1、提取DNA分子的基本思路是什么？1、DNA不溶于酒精溶液

DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可初步分離DNA與蛋白質(zhì)。（二）DNA粗提取的原理2、DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同在NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14mol/L時(shí)，DNA溶解度最??；當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時(shí)，DNA的溶解度又逐漸增大。濃度為2mol／L時(shí)，DNA的溶解度最大先用2mol/LNaCl溶液溶解DNA，再加入蒸餾水，使其溶液濃度從2mol/L下降到0.14mol/L，使DNA在鹽溶液中析出。3、DNA的鑒定在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色，因此用二苯胺試劑鑒定DNA分子。DNA+二苯胺沸水浴藍(lán)色（三）目的要求1、了解DNA的物理化學(xué)性質(zhì)；理解DNA粗提取

和鑒定的原理2、學(xué)會(huì)DNA粗提取的方法以及利用二苯胺試劑

對(duì)DNA進(jìn)行鑒定

不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時(shí)，應(yīng)本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。原則上，凡是含有DNA的生物材料都可以考慮選用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大。（四）實(shí)驗(yàn)材料的選?。?/p>

五）方法步驟：1、研磨洋蔥2、過(guò)濾獲取含DNA的上清液3、冷卻酒精析出DNA4、DNA的鑒定提取洋蔥DNA時(shí)，加研磨液充分的研磨，過(guò)濾后收集研磨液研磨目的：破碎細(xì)胞壁，使核物質(zhì)容易溶解在NaCl溶液中在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液研磨液倒入塑料離心管離心5min，再取上清液在上清液中加入體積相等的、預(yù)