高濃度發(fā)酵中酵母菌性能調(diào)控及優(yōu)化

高濃度發(fā)酵中酵母菌性能調(diào)控及優(yōu)化張琦;李文;林燕;馬海元;王欣澤;孔海南【摘要】高濃度發(fā)酵能有效提高乙醇發(fā)酵的經(jīng)濟(jì)效益，但反應(yīng)過程中高濃度基質(zhì)和產(chǎn)物對(duì)酵母菌性能抑制作用是限制最終乙醇產(chǎn)率的關(guān)鍵因素.文中通過分析比較了不同基質(zhì)及產(chǎn)物濃度下的發(fā)酵中基質(zhì)濃度、菌體濃度、乙醇產(chǎn)量的變化規(guī)律，確定酵母菌對(duì)抑制物的耐受濃度.并對(duì)比內(nèi)源和外源乙醇對(duì)于發(fā)酵初始12h酵母菌平均比增長(zhǎng)速率和平均乙醇發(fā)酵速率的影響，揭示內(nèi)夕卜源乙醇抑制作用的差異結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，該酵母菌株發(fā)酵基質(zhì)最大投加濃度為160g/L,所產(chǎn)乙醇最大濃度為55g/L;產(chǎn)物乙醇是發(fā)酵過程中的首要抑制因素，菌體對(duì)發(fā)酵初始時(shí)所添加乙醇的耐受濃度為70g/L,內(nèi)源乙醇對(duì)酵母菌的抑制作用大于外源乙醇.【期刊名稱】《食品與發(fā)酵工業(yè)》【年(卷)，期】2013(039)003【總頁數(shù)】7頁(P5-11)【關(guān)鍵詞】乙醇發(fā)酵;酵母菌抑制;基質(zhì);產(chǎn)物【作者】張琦;李文;林燕;馬海元;王欣澤;孔海南【作者單位】上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海,200240;長(zhǎng)安大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安,710064;上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海,200240;上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海,200240;上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海,200240;上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海,200240【正文語種】中文在合理控制情況下，高濃度乙醇發(fā)酵（濃醪發(fā)酵）能夠有效提高設(shè)備利用率、減少單位產(chǎn)物所消耗的能源，并降低雜菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，是提高乙醇發(fā)酵生產(chǎn)效率、降低成本的有效工藝手段。然而，高濃度基質(zhì)和產(chǎn)物對(duì)酵母菌的抑制作用導(dǎo)致菌體發(fā)酵性能低下，進(jìn)而限制最終目標(biāo)產(chǎn)物濃度［1］，仍是制約其工業(yè)化推廣的重要因素。本文分別分析在酵母菌乙醇發(fā)酵過程中基質(zhì)和產(chǎn)物對(duì)酵母菌性能的影響，系統(tǒng)研究酵母菌在不同抑制物濃度下的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能的變化規(guī)律，并且比較了實(shí)際發(fā)酵過程中酵母自身所產(chǎn)的內(nèi)源乙醇與實(shí)驗(yàn)中外源添加的乙醇對(duì)酵母菌發(fā)酵性能影響的差異，確定抑制物的作用閾值以及高濃發(fā)酵過程中的主要限制因子，為尋找減小抑制物對(duì)于酵母菌性能影響的有效措施，進(jìn)一步提高木質(zhì)纖維素乙醇生產(chǎn)效率和產(chǎn)物濃度提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1菌株釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeBY4742（-60°C保存，上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)室提供）。1.1.2生長(zhǎng)培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基［2］,pH4.0~5.0。1.1.3發(fā)酵培養(yǎng)基［3-4］NH4CI3.0g/L;KH2PO40.7g/L;MgSO4?7H2O0.35g/L;CaCl20.1g/L;NaCl0.1g/L;MnSO4?4H2O0.11g/L;CuSO4?5H2O1.0mg/L;ZnSO4?7H2O21.0mg/L;CoSO4?7H2O4.0mg/L;H3BO340.0mg/L;Na2MoO4?2H2O0.2mg/L;FeSO414.4mg/L。1.1.4發(fā)酵基質(zhì)木質(zhì)纖維素的水解液中，葡萄糖占還原糖絕對(duì)比例可達(dá)70%[5]，需著重研究以提高酵母菌對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率，故本研究采用葡萄糖作為發(fā)酵基質(zhì)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1種子培養(yǎng)復(fù)蘇后的酵母菌置于YPD液體培養(yǎng)基擴(kuò)培，于全溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，轉(zhuǎn)速180r/min，溫度37°C,培養(yǎng)16~18h。1.2.2間歇發(fā)酵按既定濃度的酵母菌、營養(yǎng)液、基質(zhì)和產(chǎn)物配制發(fā)酵反應(yīng)液，而后將其置于集成控制自動(dòng)化厭氧發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，設(shè)置參數(shù)為pH4.0,35C,200r/min，菌體濃度2g/L。每批次實(shí)驗(yàn)均平行啟用3個(gè)發(fā)酵罐同時(shí)同參數(shù)反應(yīng)以控制誤差。1.3樣品分析方法菌體濃度采用分光光度法檢測(cè)[6-7]，檢測(cè)波長(zhǎng)選用600nm;基質(zhì)（葡萄糖）和產(chǎn)物（乙醇）檢測(cè)條件:島津液相色譜儀，色譜柱BIO-RAD910-5250，柱溫65C,RID-10A檢測(cè)器，溫度60C，流動(dòng)相超純水，流速:0.8mL/min，進(jìn)樣量20pLo2實(shí)驗(yàn)分析與討論2.1高濃度基質(zhì)對(duì)乙醇發(fā)酵的抑制高濃發(fā)酵能夠提高設(shè)備利用率，減少熱能消耗和用水量，有效降低生產(chǎn)成本。但過高基質(zhì)濃度所致的高滲環(huán)境，會(huì)減弱酵母菌細(xì)胞膜流動(dòng)性及胞內(nèi)關(guān)鍵代謝酶活性[9-10],從而降低酵母菌乙醇發(fā)酵性能。當(dāng)基質(zhì)濃度高于閾值后，繼續(xù)提高基質(zhì)濃度，產(chǎn)物將增長(zhǎng)緩慢甚至停滯，造成原材料浪費(fèi)。通過基質(zhì)對(duì)酵母菌活性抑制作用的研究，能確定合理的基質(zhì)投加量，在保證基質(zhì)利用率及乙醇產(chǎn)率的前提下獲取最高的經(jīng)濟(jì)效益。實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置的基質(zhì)濃度分別為：40、80、120、160、200、280g/L。每批次發(fā)酵時(shí)間96h，每隔24h取樣。2.1.1基質(zhì)對(duì)酵母菌生長(zhǎng)的影響圖1為不同基質(zhì)濃度下酵母菌濃度變化的對(duì)比圖。當(dāng)基質(zhì)濃度低于160g/L時(shí)，菌體濃度隨著基質(zhì)濃度的提高而顯著增加。這是因?yàn)槠咸烟鞘墙湍讣?xì)胞最重要的碳源，亦是重要的初期信號(hào)分子，酵母菌會(huì)根據(jù)外界基質(zhì)變化來調(diào)節(jié)自身各種酶的表達(dá)水平及活性，達(dá)到最佳的代謝生長(zhǎng)水平，最終達(dá)到最適種群密度［9］。所以在基質(zhì)濃度較小時(shí)，不斷提高的基質(zhì)濃度改善了酵母菌的營養(yǎng)條件，酵母菌濃度隨之增長(zhǎng)。圖1不同基質(zhì)濃度下酵母菌濃度隨時(shí)間變化Fig.1Variationofyeastconcentrationunderdifferentsubstrateconcentration當(dāng)基質(zhì)濃度大于160g/L時(shí)，在反應(yīng)初期，酵母菌對(duì)高滲環(huán)境作出應(yīng)激反應(yīng)，迅速提高種群密度以加快基質(zhì)的總消耗速率，改善高滲環(huán)境，因而在前24小時(shí)有著較高的增長(zhǎng)速率。但由于高濃度基質(zhì)對(duì)酵母菌細(xì)胞膜流動(dòng)性及胞內(nèi)關(guān)鍵代謝酶的抑制作用，后期菌體增長(zhǎng)速率明顯放緩。比較發(fā)酵96h內(nèi)酵母菌的最大濃度，繼續(xù)提升基質(zhì)濃度，菌體濃度反而略有減小，可見高濃度基質(zhì)對(duì)酵母菌生長(zhǎng)繁殖存在一定的抑制作用。圖2為基質(zhì)濃度與平均對(duì)基質(zhì)菌體得率擬合圖，隨著基質(zhì)濃度的逐漸升高，平均對(duì)基質(zhì)菌體得率顯著減小，即消耗單位的葡萄糖所生成的細(xì)胞數(shù)量逐漸下降，更多的葡萄糖消耗用以維持細(xì)胞能量，印證了高基質(zhì)濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)繁殖的抑制作用。初始基質(zhì)濃度S0和平均對(duì)基質(zhì)菌體得率YX/S呈對(duì)數(shù)關(guān)系［11］，具體如下式。圖2基質(zhì)濃度與平均對(duì)基質(zhì)菌體得率擬合圖Fig.2Fittingofsubstrateconcentrationandaverageyeastyieldtosubstrate2.1.2基質(zhì)濃度對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵性能的影響圖3是不同基質(zhì)濃度下發(fā)酵所得最大乙醇濃度變化曲線，基質(zhì)濃度小于160g/L時(shí)，產(chǎn)物濃度隨基質(zhì)增加顯著提高;但當(dāng)濃度大于160g/L后，繼續(xù)增加基質(zhì)，最終乙醇濃度未見明顯增長(zhǎng)，一直穩(wěn)定在53g/L左右。因此，高于160g/L的基質(zhì)濃度對(duì)于乙醇發(fā)酵無實(shí)際意義，僅造成原材料的浪費(fèi)。圖3不同基質(zhì)濃度下最大乙醇濃度變化Fig.3Maximumethanolconcentrationsunderdifferentsubstrateconcentration圖4是不同基質(zhì)濃度下乙醇產(chǎn)率隨時(shí)間變化關(guān)系圖。隨基質(zhì)濃度增加，發(fā)酵所需時(shí)間相應(yīng)增加:80g/L至200g/L時(shí)，反應(yīng)需72h，而280g/L時(shí)，發(fā)酵96h仍未完成。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明除了發(fā)酵負(fù)荷增加外，高濃度基質(zhì)對(duì)酵母菌發(fā)酵活性的抑制亦是導(dǎo)致酵母菌性能下降及發(fā)酵反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)的主要原因。圖4不同基質(zhì)濃度下乙醇產(chǎn)率變化Fig.4Comparisonofethanolyieldsunderdifferentsubstrateconcentration就乙醇產(chǎn)率（實(shí)際乙醇產(chǎn)量與理論乙醇最大產(chǎn)量之比）而言，基質(zhì)濃度為80g/L時(shí)在48h能達(dá)到84%乙醇產(chǎn)率，而在72h時(shí)，產(chǎn)率進(jìn)一步提升至94%，乙醇最終濃度可達(dá)40g/L，達(dá)到了營養(yǎng)條件與滲透壓的平衡，是最佳的發(fā)酵基質(zhì)濃度。但在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)過程中，并非追求最高的乙醇產(chǎn)率，而是單位時(shí)間內(nèi)單位生產(chǎn)設(shè)備所產(chǎn)生的乙醇總量。因而即使最終產(chǎn)率略低，只要同生產(chǎn)一周期內(nèi)最終獲得更高的乙醇濃度，又不至于造成基質(zhì)的大量浪費(fèi)，才是符合生產(chǎn)工藝要求的基質(zhì)濃度。如當(dāng)基質(zhì)濃度為120g/L時(shí)候，雖然由于高濃度基質(zhì)對(duì)酵母性能抑制而導(dǎo)致菌體對(duì)基質(zhì)得率和最終乙醇產(chǎn)率的下降，但仍能達(dá)近80%的乙醇產(chǎn)率，所得乙醇濃度為48g/L，為工藝可接受范圍?；|(zhì)濃度為160g/L時(shí)，所得乙醇濃度為53g/L，產(chǎn)率降至65%，酵母菌活性受到較大程度的抑制，但基質(zhì)的投加仍能提升最終產(chǎn)物濃度。而當(dāng)基質(zhì)濃度大于160g/L后，繼續(xù)增加基質(zhì)投加量，乙醇產(chǎn)率和發(fā)酵速率急劇下降，相應(yīng)地，產(chǎn)物最高濃度幾乎不再增加，甚至略有減小，浪費(fèi)大量原材料和時(shí)間?；|(zhì)濃度為280g/L時(shí)，產(chǎn)率僅為40%，最終產(chǎn)物濃度為55g/L，酵母菌的發(fā)酵性能受到了嚴(yán)重抑制。因此，在實(shí)驗(yàn)條件下160g/L為基質(zhì)的最大投加濃度，高于該值時(shí)，酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵性能急劇下降，繼續(xù)增大基質(zhì)濃度對(duì)發(fā)酵已無實(shí)際意義。對(duì)于實(shí)驗(yàn)酵母菌株的性能改進(jìn)和發(fā)酵工藝的優(yōu)化是提高工業(yè)生產(chǎn)過程中投加最高基質(zhì)濃度及生產(chǎn)效益的有效措施。2.2產(chǎn)物對(duì)乙醇發(fā)酵的影響乙醇是釀酒酵母厭氧發(fā)酵的重要產(chǎn)物，但對(duì)酵母細(xì)胞本身又是毒素和抑制劑[12]。在高濃發(fā)酵過程后期，存在著基質(zhì)和產(chǎn)物的協(xié)同抑制作用。因而在研究產(chǎn)物乙醇的單獨(dú)抑制作用時(shí)，需模擬出低基質(zhì)濃度高產(chǎn)物濃度的發(fā)酵狀態(tài)，即在低基質(zhì)濃度的初始反應(yīng)條件下，額外加入不同濃度乙醇，從而得出產(chǎn)物對(duì)厭氧乙醇發(fā)酵過程中酵母菌性能的單獨(dú)抑制作用。實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置的初始添加乙醇濃度梯度為0、10、20、30、40、50、60、70、80g/L,基質(zhì)濃度均選為80g/L,發(fā)酵96h，每隔24h取樣。2.2.1產(chǎn)物對(duì)酵母菌生長(zhǎng)抑制圖5是不同初始乙醇濃度下酵母菌生長(zhǎng)情況對(duì)比。圖5不同初始乙醇濃度下菌體濃度隨時(shí)間變化Fig.5Variationofyeastconcentrationunderdifferentinitialethanolconcentration初始添加的乙醇對(duì)于酵母菌的增長(zhǎng)具有抑制作用，在低濃度乙醇(小于30g/L)情況下，菌體量的增幅雖隨著乙醇濃度提高緩慢減小，但最高菌體濃度對(duì)比初始濃度仍有70%以上的增長(zhǎng)，且菌體濃度在24h已達(dá)最大值，外源乙醇對(duì)于酵母菌增長(zhǎng)的抑制作用不明顯;而在較高乙醇濃度(30~50g/L)下，酵母菌的濃度最高只增長(zhǎng)了30%左右，酵母菌的生長(zhǎng)開始受到了較嚴(yán)重的抑制，同時(shí)酵母菌的延滯適應(yīng)期也明顯增加，對(duì)于初始添加40g/L乙醇時(shí)，酵母菌在24h基本未增長(zhǎng)，在48h達(dá)最大濃度，而初始添加50g/L乙醇時(shí)，前48h菌體均處于停滯期，72h才達(dá)最大濃度;繼續(xù)增高乙醇濃度，酵母菌在整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間段內(nèi)均增長(zhǎng)非常緩慢，菌體濃度增長(zhǎng)率均小于10%，當(dāng)乙醇濃度大于70g/L后，菌體濃度完全停止增加，甚至略有減小，酵母菌的生長(zhǎng)繁殖由于受到了高濃度產(chǎn)物的強(qiáng)烈抑制作用已完全停止。2.2.2產(chǎn)物對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵性能的抑制雖然乙醇在低濃度時(shí)對(duì)于酵母菌的生長(zhǎng)無明顯抑制作用，但對(duì)于酵母菌葡萄糖代謝活性卻有著顯著抑制作用。由圖6不同初始濃度下葡萄糖轉(zhuǎn)化率比較可得，就最終的葡萄糖的轉(zhuǎn)化率而言，隨著乙醇添加量的增加而迅速減小：在空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，酵母菌96h能夠消耗所有的葡萄糖，乙醇濃度10g/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率為60%;而在20g/L時(shí)，葡萄糖轉(zhuǎn)化率進(jìn)一步下降到只有30%;乙醇濃度大于70g/L后，葡萄糖幾乎不再消耗，酵母菌對(duì)葡萄糖的代謝受到嚴(yán)重抑制。圖6不同初始乙醇濃度下葡萄糖轉(zhuǎn)化率比較Fig.6Comparisonofglucoseconsumptionrateunderdifferentinitialethanolconcentration通過對(duì)比圖6和圖7可以得出，葡萄糖轉(zhuǎn)化率和乙醇產(chǎn)率變化規(guī)律非常一致，酵母菌消耗的葡萄糖幾乎均有效轉(zhuǎn)化為乙醇。由此可推斷，在乙醇發(fā)酵過程中，葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝是主要限制性因素，是整個(gè)發(fā)酵過程中限速步驟［13-14］，最終乙醇產(chǎn)率低下主要原因是受到上游代謝途徑中葡萄糖轉(zhuǎn)化率低下所制約。因而提高糖酵解途徑及糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中關(guān)鍵酶在高乙醇濃度下的活性是加強(qiáng)酵母菌乙醇發(fā)酵性能的重要措施。圖7不同初始濃度乙醇下乙醇產(chǎn)率變化Fig.7Comparisonofethanolyieldunderdifferentinitialethanolconcentration鑒于圖5中所示不同乙醇濃度下酵母菌濃度存在較大差異，為了排除菌體濃度對(duì)乙醇發(fā)酵性能的影響，故采用單位質(zhì)量酵母菌單位時(shí)間所產(chǎn)乙醇質(zhì)量即乙醇發(fā)酵速率［15］來表征在不同乙醇濃度下的酵母菌實(shí)際發(fā)酵性能。圖8是不同的初始乙醇濃度下乙醇發(fā)酵速率的變化曲線。圖8不同初始濃度乙醇下乙醇發(fā)酵速率變化Fig.8Comparisonofethanolfermentationrateunderdifferentinitialethanolconcentration由圖8可得:（1）隨著初始乙醇濃度的提高，各時(shí)段乙醇發(fā)酵速率總體呈下降趨勢(shì)。對(duì)于各反應(yīng)時(shí)間段，0~24h發(fā)酵速率差異最大，而反應(yīng)后期，由于本身乙醇發(fā)酵速率均較小，因而在不同初始乙醇濃度下發(fā)酵速率差異性較小，圖中24~48h、48~72h、72-96h3條曲線較0~24h明顯平緩。（2）不同初始乙醇濃度下發(fā)酵速率變化也存在明顯區(qū)別。在較低初始乙醇濃度（小于30g/L）情況下，前24h的乙醇發(fā)酵速率顯著高于后期的乙醇發(fā)酵速率，發(fā)酵后期，由于酵母菌自身產(chǎn)生的內(nèi)源乙醇疊加抑制作用，加之底物和營養(yǎng)物質(zhì)消耗，酵母菌所處系統(tǒng)環(huán)境更為惡劣;相反地，對(duì)于高濃度初始乙醇的發(fā)酵環(huán)境，整個(gè)過程中乙醇發(fā)酵速率無顯著變化，甚至部分后期發(fā)酵速率高于前期，這是由于系統(tǒng)本身的乙醇增量不明顯，并且底物和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗均很少，環(huán)境變化不大，因而逐漸適應(yīng)高濃度乙醇環(huán)境的酵母菌發(fā)酵性能可保持穩(wěn)定，甚至在后期略有提升。在模擬的高產(chǎn)物低基質(zhì)濃度發(fā)酵環(huán)境中，乙醇對(duì)酵母菌生長(zhǎng)和發(fā)酵性能具有嚴(yán)重抑制作用，是影響最終木質(zhì)纖維素乙醇生產(chǎn)效益的重要因素。究其原因，除了嚴(yán)重抑制酵母細(xì)胞糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑外［14］，乙醇還抑制細(xì)胞膜上ATP酶活性導(dǎo)致質(zhì)子濃度梯度的破壞，造成胞內(nèi)營養(yǎng)元素的流失，同時(shí)又改變細(xì)胞膜上的磷脂組分和麥角固醇含量，增加細(xì)胞膜非特異透過性，削弱其對(duì)酵母細(xì)胞的保護(hù)作用;另外乙醇還引起胞內(nèi)線粒體氧化損傷，進(jìn)一步降低了酵母菌的乙醇發(fā)酵性能［16-17］。正是由于乙醇對(duì)酵母細(xì)胞多方面的毒害作用，酵母菌對(duì)乙醇非常敏感，為保持酵母菌較高生長(zhǎng)和發(fā)酵活性，需保證發(fā)酵液中乙醇濃度小于30g/L。當(dāng)產(chǎn)物濃度大于酵母菌對(duì)外源乙醇的最大耐受濃度70g/L后，菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵完全停止。設(shè)法降低產(chǎn)物的抑制作用是提升乙醇產(chǎn)率最為直接和有效的途徑。2.2.3內(nèi)外卜源乙醇抑制對(duì)比2.2.1和2.2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了產(chǎn)物乙醇對(duì)于酵母菌厭氧乙醇發(fā)酵的強(qiáng)烈抑制作用，但模擬實(shí)驗(yàn)和實(shí)際發(fā)酵結(jié)果還存在一定區(qū)別:如在基質(zhì)抑制實(shí)驗(yàn)中得到酵母乙醇發(fā)酵的實(shí)際過程中，最大產(chǎn)物濃度僅55g/L，此結(jié)果低于外源乙醇抑制實(shí)驗(yàn)中所得到的最大耐受濃度70g/L。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因除了發(fā)酵初期高濃度基質(zhì)對(duì)酵母菌乙醇發(fā)酵性能的協(xié)同抑制作用外，外源添加的乙醇與酵母菌自身發(fā)酵所產(chǎn)生的內(nèi)源乙醇對(duì)于酵母菌的抑制作用的差異也有可能是重要原因，因此有必要系統(tǒng)對(duì)比相同濃度下內(nèi)源和外源乙醇對(duì)于酵母發(fā)酵的抑制作用。設(shè)置的夕卜源乙醇濃度為10、20、30、40、50、60、70、80g/L，只測(cè)定不同外源乙醇濃度下0h,12h的酵母菌濃度、葡萄糖濃度和乙醇濃度，以排除后期酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的內(nèi)源乙醇抑制作用的干擾;內(nèi)源乙醇抑制對(duì)比實(shí)驗(yàn)取樣時(shí)間為每隔12h,共96h,初始不添加乙醇，其余實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)條件保持完全一致不采用。內(nèi)外卜源乙醇濃度酵母菌比增長(zhǎng)速率的對(duì)比情況同見圖9。當(dāng)乙醇濃度小于15g/L時(shí)，內(nèi)外卜源乙醇對(duì)于酵母菌的生長(zhǎng)抑制作用沒有明顯區(qū)別;乙醇濃度大于15g/L時(shí)，與外源乙醇環(huán)境相比較，在內(nèi)源乙醇環(huán)境中的酵母菌比增長(zhǎng)速率減小幅度明顯加劇。在28g/L內(nèi)源乙醇下，菌體比增長(zhǎng)速率已降為零，而對(duì)于外源乙醇，酵母菌耐受濃度達(dá)70g/L,高濃度情況下內(nèi)源乙醇對(duì)于酵母菌生長(zhǎng)的抑制作用顯著大于外源乙醇。圖9內(nèi)外源乙醇下12h酵母菌平均比增長(zhǎng)速率對(duì)比圖Fig.9Comparisonof12h-averagedspecificyeastgrowthrateunderendogenousandexogenousethanol圖9內(nèi)夕卜源乙醇作用下乙醇發(fā)酵速率的對(duì)比曲線見圖10。在相同濃度下，內(nèi)源乙醇作用下酵母菌乙醇發(fā)酵速率均低于外源乙醇作用下的發(fā)酵速率，即酵母菌對(duì)內(nèi)源乙醇更為敏感，如當(dāng)乙醇濃度為38g/L時(shí)，內(nèi)源乙醇下發(fā)酵速率已經(jīng)很低，僅為0.005g乙醇/g酵母菌?h），而外源乙醇下發(fā)酵速率仍大于0.200g乙醇/g酵母菌加。由圖10可得，就乙醇發(fā)酵速率隨乙醇濃度的衰減規(guī)律，外源乙醇下呈線性衰減，而內(nèi)源乙醇時(shí)則為高次幕衰減［18］。圖10內(nèi)外源乙醇下12h乙醇平均發(fā)酵速率對(duì)比圖Fig.10Comparisonof12haveragedethanolfermentationrateunderendogenousandexogenousethanol在對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，所選基質(zhì)濃度為80g/L,而綜合先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)反應(yīng)的基質(zhì)濃度更高時(shí)，由于酵母菌對(duì)高濃發(fā)酵環(huán)境的逐漸適應(yīng)，其乙醇耐受濃度有所增加，所以酵母菌發(fā)酵對(duì)內(nèi)源乙醇最大耐受濃度為2.1所述實(shí)際發(fā)酵中所獲得的最高產(chǎn)物濃度55g/L。綜上所述，無論對(duì)酵母菌的增長(zhǎng)抑或發(fā)酵性能，內(nèi)源乙醇的抑制作用均大于外源乙醇的抑制作用。分析原因，主要由于發(fā)酵過程中乙醇向細(xì)胞外散速率有限，導(dǎo)致酵母細(xì)胞內(nèi)乙醇濃度高于胞外［19］，而細(xì)胞內(nèi)部高濃度乙醇的長(zhǎng)時(shí)間積累以及向胞外的持續(xù)滲透不斷抑制著酵母細(xì)胞的生理活性，其影響程度大于高濃度外源乙醇對(duì)酵母菌的沖擊。另外，由于細(xì)胞膜的保護(hù)作用，減緩降低了夕卜源乙醇向細(xì)胞內(nèi)的滲透和毒害作用，減小及延緩了乙醇對(duì)細(xì)胞內(nèi)酶活及胞內(nèi)器官的損害。所以，若在產(chǎn)物乙醇累計(jì)至高濃度后才提取，可能對(duì)于恢復(fù)酵母活性以提高最終乙醇發(fā)酵效率作用不大，因?yàn)榘麅?nèi)高濃度乙醇的積累及向夕卜滲透過程已經(jīng)造成了酵母細(xì)胞不可逆破壞;而若通過循壞氣提、真空提取法等發(fā)酵提取耦合技術(shù)，始終將乙醇維持在較低濃度，雖可以有效減小產(chǎn)物對(duì)酵母菌的抑制作用［20-21］，卻對(duì)工藝提出更高要求，亦進(jìn)一步增加生產(chǎn)成本，需要對(duì)兩者作出權(quán)衡。在實(shí)際發(fā)酵過程中的高濃度內(nèi)源乙醇環(huán)境下，酵母菌的生長(zhǎng)和發(fā)酵均受到了更嚴(yán)重的抑制，酵母菌的最大耐受濃度小于70g/L,所以在高產(chǎn)物濃度下，提高酵母菌的生長(zhǎng)及發(fā)酵活性對(duì)于保證最終的高乙醇產(chǎn)量和生產(chǎn)效益顯得更為重要。2.3高濃發(fā)酵中酵母菌性能關(guān)鍵指標(biāo)通過以上實(shí)驗(yàn)，定量表述了高濃發(fā)酵中酵母菌SaccharomycescerevisiaeBY4742在不同基質(zhì)和產(chǎn)物濃度下生長(zhǎng)及發(fā)酵活性的變化情況，并得出了實(shí)驗(yàn)酵母菌的性能關(guān)鍵指標(biāo)，即其對(duì)基質(zhì)和產(chǎn)物的耐受濃度。詳見表1。表1SaccharomycescerevisiaeBY4742發(fā)酵關(guān)鍵濃度指標(biāo)Table1KeyconcentrationsindexforSaccharomycescerevisiaeBY4742描述葡萄糖80類型濃度/gi-l)最佳發(fā)酵基質(zhì)濃度葡萄糖160最大投加濃度乙醇28內(nèi)源乙醇下酵母菌生長(zhǎng)耐受濃度乙醇55實(shí)際發(fā)酵過程中最大產(chǎn)物濃度即內(nèi)源乙醇下酵母菌發(fā)酵耐受濃度乙醇70外源乙醇下酵母菌生長(zhǎng)及發(fā)酵耐受濃度3總結(jié)與展望本文以燃料乙醇生產(chǎn)環(huán)節(jié)中重要的發(fā)酵步驟為研究對(duì)象，探索了基質(zhì)和產(chǎn)物對(duì)厭氧乙醇發(fā)酵過程中酵母生長(zhǎng)及發(fā)酵性能的抑制作用，確定了基質(zhì)對(duì)酵母菌性能抑制的臨界濃度值以及酵母菌所能耐受的最大產(chǎn)物濃度，同時(shí)比較了內(nèi)源和外卜源乙醇對(duì)酵母菌抑制程度的差異，所得結(jié)論如下：酵母菌乙醇發(fā)酵的最佳基質(zhì)濃度為80g/L,乙醇產(chǎn)率可達(dá)94%。繼續(xù)提高基質(zhì)濃度，雖然乙醇產(chǎn)率有所下降，但仍能達(dá)到80%，且發(fā)酵所產(chǎn)乙醇濃度也不斷增加，可至55g/L;當(dāng)基質(zhì)濃度大于臨界值160g/L后，由于受到高濃度基質(zhì)的顯著抑制作用，產(chǎn)率降至65%以下，且最終發(fā)酵所得乙醇濃度和最終菌體濃度都幾乎不再增加，甚至略有減小，基質(zhì)濃度繼續(xù)提高對(duì)于乙醇發(fā)酵已無實(shí)際意義。產(chǎn)物乙醇對(duì)于酵母菌的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能具有顯著抑制作用，是高濃發(fā)酵過程中制約乙醇產(chǎn)量的重要因素。⑶內(nèi)源乙醇對(duì)酵母菌生長(zhǎng)及乙醇發(fā)酵性能的抑制作用均大于外源乙醇。單就乙醇發(fā)酵而言，酵母菌對(duì)于外源乙醇的最大耐受濃度為70g/L,對(duì)內(nèi)源乙醇該濃度則為55g/L。所以，設(shè)法保證酵母菌在高濃度產(chǎn)物下的活性是提高乙醇總產(chǎn)量進(jìn)而推廣木質(zhì)纖維素制乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的最為直接和關(guān)鍵措施。對(duì)于減弱乙醇的抑制作用、提高酵母活性，還可從以下幾方面進(jìn)行：篩選、馴化或通過基因工程改造酵母菌，取得高乙醇耐受性酵母菌株，保證其仍能在高濃度乙醇環(huán)境中保持較高活性，以減小乙醇抑制作用。反應(yīng)進(jìn)程中及時(shí)添加酵母所需微量元素及其他營養(yǎng)物質(zhì)，以彌補(bǔ)反應(yīng)中營養(yǎng)物質(zhì)流失及消耗而導(dǎo)致的酵母活性降低的問題。⑶反應(yīng)至一定進(jìn)程后，及時(shí)提取發(fā)酵液中乙醇，同時(shí)添加少量高活性新鮮酵母，以達(dá)到降低最終殘?zhí)菨舛?、提高乙醇產(chǎn)率之目的。參考文獻(xiàn)[1]PuligundlaP,SmogrovicovaD,ObulamVSR,etal.Veryhighgravity(VHG)ethanolicbrewingandfermentation:aresearchupdate[J].JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology,2011,38(9):1133-1144.[2]喬宗偉，張文學(xué)，張麗鶯，等.濃香型白酒糟醅微生物分離培養(yǎng)基的選擇研究[J].釀酒科技，2004,25(6):30-32.[3]AnastassiadisS,KamzolovaS,MorgunovI,etal.Comparativestudyoftheeffectofirononcitrate-producingyeastgrowingondifferentsubstrates.Communicafingcurrentresearchandeducationaltopicsandtrendsinappliedmicrobiology[C].BajadozSpain:Formatex,2007:308-314.[4]曹憲周，牛芳方，楊兆明，等.各種維生素及微量元素在酵母菌生長(zhǎng)過程中的優(yōu)化[J].糧油加工，2009,40(10):121-123.[5]KatahiraS,MizuikeA,FukudaH,etal.Ethanolfermentationfromlignocellulosichydrolysatebyarecombinantxyloseandcellooligosaccharideassimilatingyeaststrain[J].AppliedMicrobiology[6]嚴(yán)益民.比濁法在測(cè)定發(fā)醇液菌體濃度中的應(yīng)用[J].撫順石油學(xué)院學(xué)報(bào)，2001,21(1):23-26.[7]楊帆，李淑梅，陳萍，等.發(fā)酵過程中菌液濃度的檢測(cè)[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2009,26(6):1643-1645.[8]李偉軍，韋新桂，叢威，等.高效液相色譜法同時(shí)分析低濃度的葡萄糖，乙醇和甘油[J].色譜，2000,18(2):170-172.[9]湯佳鑫，王繼花，俞志敏，等.滲透壓對(duì)釀酒酵母胞內(nèi)代謝關(guān)鍵酶活性的影響[J].釀酒科技，2008,29(5):45-49.[10]ThomasK,IngledewW.Productionof21%(v/v)ethanolbyfermentationofveryhighgravity(VHG)wheatmashes[J].JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology,1992,10(1):61-68.[11]呂欣，李永飛，段作營，等.不同基質(zhì)濃度對(duì)酒精發(fā)酵的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003,29(7):21-23.[12]賀家明，趙祥穎.酵母耐乙醇性狀及提高其乙醇耐性的途徑[J].山東食品發(fā)酵，1999,29(3):6-11.[13]AlexandreH,CharpentierC.Biochemicalaspectsofstuckandsluggishfermentationingrapemust[J].JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology,1998,20(1):20-27.[14]蔣常德.木薯燃料酒精濃